Nature.com پر جانے کا شکریہ۔آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔بہترین تجربے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کریں)۔اس دوران، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ کے رینڈر کریں گے۔
پلمونری سسٹک فائبروسس کے علاج کے لیے جین ویکٹر کو کنڈکٹیو ایئر ویز کو نشانہ بنانا چاہیے، کیونکہ پردیی پھیپھڑوں کی نقل و حمل کا کوئی علاج اثر نہیں ہوتا ہے۔وائرل ٹرانزیکشن کی کارکردگی کا براہ راست تعلق کیریئر کے رہائش کے وقت سے ہے۔تاہم، ڈیلیوری سیال جیسے جین کیریئرز سانس کے دوران قدرتی طور پر الیوولی میں پھیل جاتے ہیں، اور کسی بھی شکل کے علاج کے ذرات کو میوکوکیلیری ٹرانسپورٹ کے ذریعے تیزی سے ہٹا دیا جاتا ہے۔سانس کی نالی میں جین کیریئرز کے قیام کے وقت کو بڑھانا اہم ہے لیکن اسے حاصل کرنا مشکل ہے۔کیریئر سے منسلک مقناطیسی ذرات جو سانس کی نالی کی سطح کی طرف لے جا سکتے ہیں علاقائی ہدف کو بہتر بنا سکتے ہیں۔ویوو امیجنگ میں مسائل کی وجہ سے، لاگو مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں ہوا کی نالی کی سطح پر ایسے چھوٹے مقناطیسی ذرات کے رویے کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔اس مطالعے کا مقصد ویوو میں سنگل اور بلک ذرات کے طرز عمل کی حرکیات اور طرز عمل کا مطالعہ کرنے کے لیے اینستھیٹائزڈ چوہوں کی ٹریچیا میں مقناطیسی ذرات کی ایک سیریز کی حرکت کو ویوو میں دیکھنے کے لیے سنکروٹرون امیجنگ کا استعمال کرنا تھا۔اس کے بعد ہم نے یہ بھی جائزہ لیا کہ آیا مقناطیسی میدان کی موجودگی میں لینٹیو وائرل مقناطیسی ذرات کی ترسیل سے چوہے کی ٹریچیا میں نقل و حمل کی کارکردگی میں اضافہ ہوگا۔سنکروٹرون ایکس رے امیجنگ وٹرو اور ویوو میں اسٹیشنری اور حرکت پذیر مقناطیسی شعبوں میں مقناطیسی ذرات کے رویے کو ظاہر کرتی ہے۔میگنےٹ کا استعمال کرتے ہوئے ذرات کو زندہ ایئر ویز کی سطح پر آسانی سے گھسیٹا نہیں جا سکتا، لیکن نقل و حمل کے دوران، ذخائر منظر کے میدان میں مرکوز ہوتے ہیں، جہاں مقناطیسی میدان سب سے زیادہ مضبوط ہوتا ہے۔جب مقناطیسی میدان کی موجودگی میں لینٹیو وائرل مقناطیسی ذرات کی ترسیل کی گئی تو نقل و حمل کی کارکردگی میں بھی چھ گنا اضافہ ہوا۔ایک ساتھ لے کر، یہ نتائج بتاتے ہیں کہ lentiviral مقناطیسی ذرات اور مقناطیسی فیلڈز Vivo میں conductive airways میں جین ویکٹر کو نشانہ بنانے اور نقل و حمل کی سطح کو بہتر بنانے کے لیے قابل قدر نقطہ نظر ہو سکتے ہیں۔
سسٹک فائبروسس (CF) ایک واحد جین میں تغیرات کی وجہ سے ہوتا ہے جسے CF ٹرانس میمبرین کنڈکٹنس ریگولیٹر (CFTR) کہا جاتا ہے۔CFTR پروٹین ایک آئن چینل ہے جو پورے جسم میں بہت سے اپکلا خلیوں میں موجود ہے، بشمول ایئر ویز، سسٹک فائبروسس کے روگجنن میں ایک اہم مقام۔CFTR میں خرابی غیر معمولی پانی کی نقل و حمل، ایئر وے کی سطح کی پانی کی کمی، اور ایئر وے کی سطح کی سیال تہہ (ASL) کی گہرائی میں کمی کا باعث بنتی ہے۔یہ سانس لینے والے ذرات اور پیتھوجینز کے ایئر ویز کو صاف کرنے کے لیے میوکوکیلیری ٹرانسپورٹ (MCT) سسٹم کی صلاحیت کو بھی متاثر کرتا ہے۔ہمارا مقصد CFTR جین کی صحیح نقل فراہم کرنے اور ASL، MCT، اور پھیپھڑوں کی صحت کو بہتر بنانے کے لیے ایک lentiviral (LV) جین تھراپی تیار کرنا ہے، اور نئی ٹیکنالوجیز تیار کرنا جاری رکھنا ہے جو vivo1 میں ان پیرامیٹرز کی پیمائش کر سکیں۔
LV ویکٹر سسٹک فائبروسس جین تھراپی کے سرکردہ امیدواروں میں سے ایک ہیں، بنیادی طور پر اس لیے کہ وہ علاج کے جین کو مستقل طور پر ایئر وے بیسل سیلز (ایئر وے سٹیم سیلز) میں ضم کر سکتے ہیں۔یہ اس لیے اہم ہے کیونکہ وہ سسٹک فائبروسس سے وابستہ فنکشنل جین سے درست ایئر وے کی سطح کے خلیوں میں فرق کر کے عام ہائیڈریشن اور بلغم کی صفائی کو بحال کر سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں زندگی بھر کے فوائد حاصل ہوتے ہیں۔LV ویکٹروں کو کنڈکٹیو ایئر ویز کے خلاف ہدایت کرنی چاہیے، کیونکہ یہیں سے CF میں پھیپھڑوں کی شمولیت شروع ہوتی ہے۔پھیپھڑوں میں گہرائی تک ویکٹر کی ترسیل کے نتیجے میں الیوولر ٹرانسڈکشن ہو سکتا ہے، لیکن سسٹک فائبروسس میں اس کا کوئی علاج اثر نہیں ہوتا ہے۔تاہم، مائعات جیسے جین کیریئرز قدرتی طور پر الیوولی میں منتقل ہو جاتے ہیں جب بچے کی پیدائش کے بعد سانس لیا جاتا ہے 3,4 اور علاج کے ذرات کو MCTs کے ذریعے زبانی گہا میں تیزی سے نکال دیا جاتا ہے۔ایل وی ٹرانسڈکشن کی کارکردگی کا براہ راست تعلق اس وقت کی لمبائی سے ہے جو ویکٹر ٹارگٹ سیلز کے قریب رہتا ہے تاکہ سیلولر اپٹیک - "رہائش کا وقت" 5 جو عام علاقائی ہوا کے بہاؤ کے ساتھ ساتھ بلغم اور MCT ذرات کے مربوط اخراج کے ذریعہ آسانی سے مختصر ہوجاتا ہے۔سسٹک فائبروسس کے لیے، ایئر ویز میں LV رہائش کے وقت کو طول دینے کی صلاحیت اس علاقے میں اعلیٰ سطح کی نقل و حمل کو حاصل کرنے کے لیے اہم ہے، لیکن اب تک یہ چیلنجنگ رہا ہے۔
اس رکاوٹ کو دور کرنے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ LV مقناطیسی ذرات (MPs) دو تکمیلی طریقوں سے مدد کر سکتے ہیں۔سب سے پہلے، انہیں مقناطیس کے ذریعے ایئر وے کی سطح پر لے جایا جا سکتا ہے تاکہ ہدف کو بہتر بنایا جا سکے اور جین کیریئر کے ذرات کو ایئر وے کے صحیح حصے میں رہنے میں مدد مل سکے۔اور ASL) سیل کی تہہ میں منتقل ہو جاتے ہیں۔ جامد بجلی کی موجودگیکینسر کے علاج کے لیے مقناطیسی میدان 7. دیگر "ہائپر تھرمک" طریقوں کا مقصد ایم پیز کو گرم کر کے ٹیومر کے خلیات کو مارنا ہے جب مقناطیسی شعبوں کو دوہرایا جاتا ہے۔مقناطیسی منتقلی کا اصول، جس میں ڈی این اے کی خلیات میں منتقلی کو بڑھانے کے لیے ایک مقناطیسی فیلڈ کو بطور ٹرانسفیکشن ایجنٹ استعمال کیا جاتا ہے، عام طور پر وٹرو میں استعمال کیا جاتا ہے جو کہ مشکل سے منتقل ہونے والی سیل لائنوں کے لیے غیر وائرل اور وائرل جین ویکٹر کی ایک رینج کا استعمال کرتے ہوئے استعمال ہوتا ہے۔ ..ایک جامد مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں انسانی برونکیل اپیتھیلیم کی سیل لائن میں وٹرو میں LV MP کی ترسیل کے ساتھ LV میگنیٹو ٹرانسفیکشن کی کارکردگی قائم کی گئی تھی، جس سے صرف LV ویکٹر کے مقابلے میں نقل و حمل کی کارکردگی میں 186 گنا اضافہ ہوتا ہے۔LV MT کو سسٹک فائبروسس کے ایک ان وٹرو ماڈل پر بھی لاگو کیا گیا ہے، جہاں مقناطیسی منتقلی نے سسٹک فائبروسس اسپتم 10 کی موجودگی میں 20 کے عنصر سے ایئر مائع انٹرفیس کلچرز میں LV کی منتقلی میں اضافہ کیا۔تاہم، ویوو آرگن میگنیٹو ٹرانسفیکشن میں نسبتاً کم توجہ دی گئی ہے اور صرف چند جانوروں کے مطالعے میں اس کا جائزہ لیا گیا ہے 11,12,13,14,15، خاص طور پر پھیپھڑوں میں 16,17۔تاہم، سسٹک فائبروسس میں پھیپھڑوں کے علاج میں مقناطیسی منتقلی کے امکانات واضح ہیں۔Tan et al.(2020) نے کہا کہ "مقناطیسی نینو پارٹیکلز کی مؤثر پلمونری ڈیلیوری پر توثیق کا مطالعہ سسٹک فائبروسس کے مریضوں میں طبی نتائج کو بہتر بنانے کے لیے مستقبل کی CFTR سانس کی حکمت عملیوں کے لیے راہ ہموار کرے گا"۔
لاگو مقناطیسی میدان کی موجودگی میں سانس کی نالی کی سطح پر چھوٹے مقناطیسی ذرات کے رویے کو تصور کرنا اور مطالعہ کرنا مشکل ہے، اور اس لیے ان کو بخوبی سمجھا جاتا ہے۔دیگر مطالعات میں، ہم نے گیس چینل کی سطح کی ہائیڈریشن کی براہ راست پیمائش کرنے کے لیے ASL18 کی گہرائی اور MCT19 رویے، 20 میں ویوو تبدیلیوں میں غیر جارحانہ امیجنگ اور منٹ کی مقدار درست کرنے کے لیے Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray امیجنگ (PB-PCXI) طریقہ تیار کیا ہے۔ اور علاج کی تاثیر کے ابتدائی اشارے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔اس کے علاوہ، ہمارا MCT اسکور کرنے کا طریقہ ایلومینا یا ہائی ریفریکٹیو انڈیکس گلاس پر مشتمل 10–35 µm قطر کے ذرات کا استعمال کرتا ہے جیسا کہ MCT مارکر PB-PCXI21 کے ساتھ دکھائی دیتے ہیں۔دونوں طریقے ایم پیز سمیت ذرہ کی اقسام کی امیجنگ کے لیے موزوں ہیں۔
اعلی مقامی اور وقتی ریزولوشن کی وجہ سے، ہمارے PB-PCXI پر مبنی ASL اور MCT Asses Vivo میں سنگل اور بلک پارٹیکلز کی حرکیات اور طرز عمل کے نمونوں کا مطالعہ کرنے کے لیے موزوں ہیں تاکہ MP جین کی ترسیل کے طریقوں کو سمجھنے اور ان کو بہتر بنانے میں ہماری مدد کی جا سکے۔ہم یہاں جو نقطہ نظر استعمال کرتے ہیں وہ SPring-8 BL20B2 بیم لائن کا استعمال کرتے ہوئے ہمارے مطالعات پر مبنی ہے، جس میں ہم نے مشاہدہ کردہ ہمارے متضاد جین اظہار کے نمونوں کی وضاحت کرنے میں مدد کے لیے چوہوں کے ناک اور پلمونری ایئر ویز میں ڈمی ویکٹر کی خوراک کی ترسیل کے بعد سیال کی نقل و حرکت کا تصور کیا۔ ہمارے جین میں.3.4 کی کیریئر خوراک کے ساتھ جانوروں کا مطالعہ
اس مطالعے کا مقصد زندہ چوہوں کی ٹریچیا میں ایم پیز کی ایک سیریز کی vivo کی حرکت کو دیکھنے کے لیے PB-PCXI synchrotron کا استعمال کرنا تھا۔یہ PB-PCXI امیجنگ اسٹڈیز MP سیریز، مقناطیسی میدان کی طاقت، اور MP تحریک پر ان کے اثر کا تعین کرنے کے لیے مقام کو جانچنے کے لیے ڈیزائن کیے گئے تھے۔ہم نے فرض کیا کہ ایک بیرونی مقناطیسی میدان ڈیلیور شدہ MF کو ٹارگٹ ایریا میں رہنے یا منتقل ہونے میں مدد کرے گا۔ان مطالعات نے ہمیں مقناطیس کی ترتیب کا تعین کرنے کی بھی اجازت دی جو جمع ہونے کے بعد ٹریچیا میں رہ جانے والے ذرات کی مقدار کو زیادہ سے زیادہ کرتی ہے۔مطالعے کی ایک دوسری سیریز میں، ہم نے اس بہترین ترتیب کو استعمال کرنے کا ارادہ کیا ہے کہ LV-MPs کی چوہے کے ایئر ویز کو Vivo کی ترسیل کے نتیجے میں نقل و حمل کے نمونے کا مظاہرہ کریں، اس مفروضے پر کہ LV-MPs کی ترسیل ایئر وے کو نشانہ بنانے کے تناظر میں ہو گی۔ بڑھتی ہوئی LV نقل و حمل کی کارکردگی میں۔.
تمام جانوروں کے مطالعے ایڈیلیڈ یونیورسٹی (M-2019-060 اور M-2020-022) اور SPring-8 Synchrotron Animal Ethics کمیٹی کے منظور کردہ پروٹوکول کے مطابق کیے گئے تھے۔تجربات ARRIVE کی سفارشات کے مطابق کیے گئے تھے۔
تمام ایکس رے تصاویر جاپان میں SPring-8 synchrotron پر BL20XU بیم لائن پر لی گئی تھیں جیسا کہ پہلے 21,22 میں بیان کیا گیا تھا۔مختصراً، تجرباتی باکس سنکروٹون اسٹوریج رنگ سے 245 میٹر کے فاصلے پر واقع تھا۔0.6 میٹر کا نمونہ سے ڈٹیکٹر کا فاصلہ پارٹیکل امیجنگ اسٹڈیز کے لیے اور 0.3 میٹر Vivo امیجنگ اسٹڈیز میں فیز کنٹراسٹ اثرات پیدا کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔25 keV کی توانائی کے ساتھ ایک یک رنگی بیم استعمال کی گئی تھی۔تصاویر ایک اعلی ریزولیوشن ایکس رے ٹرانسڈیوسر (SPring-8 BM3) کے ساتھ ایک sCMOS ڈیٹیکٹر کے ساتھ حاصل کی گئیں۔ٹرانسڈیوسر 10 µm موٹے سینٹیلیٹر (Gd3Al2Ga3O12) کا استعمال کرتے ہوئے ایکس رے کو مرئی روشنی میں تبدیل کرتا ہے، جسے پھر ×10 (NA 0.3) مائکروسکوپ مقصد کا استعمال کرتے ہوئے sCMOS سینسر کی طرف بھیج دیا جاتا ہے۔sCMOS ڈیٹیکٹر ایک Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) تھا جس کی صف کا سائز 2048 × 2048 پکسلز اور خام پکسل سائز 6.5 × 6.5 µm تھا۔یہ ترتیب 0.51 µm کا ایک مؤثر آئسوٹروپک پکسل سائز اور تقریباً 1.1 ملی میٹر × 1.1 ملی میٹر کا منظر پیش کرتی ہے۔100 ایم ایس کی نمائش کا دورانیہ ایئر ویز کے اندر اور باہر مقناطیسی ذرات کے سگنل ٹو شور کے تناسب کو زیادہ سے زیادہ کرنے کے لیے منتخب کیا گیا تھا جبکہ سانس کی وجہ سے حرکت کے نمونے کو کم سے کم کیا گیا تھا۔ویوو اسٹڈیز کے لیے، ایکس رے کے راستے میں ایک تیز ایکس رے شٹر رکھا گیا تھا تاکہ ایکس رے بیم کو ایکسپوژرز کے درمیان روک کر تابکاری کی خوراک کو محدود کیا جا سکے۔
LV میڈیا کسی بھی SPring-8 PB-PCXI امیجنگ اسٹڈیز میں استعمال نہیں کیا گیا تھا کیونکہ BL20XU امیجنگ چیمبر بائیو سیفٹی لیول 2 مصدقہ نہیں ہے۔اس کے بجائے، ہم نے دو کمرشل وینڈرز سے اچھی خصوصیات والے ایم پیز کی ایک رینج کا انتخاب کیا جس میں سائز، مواد، لوہے کے ارتکاز، اور ایپلی کیشنز کا احاطہ کیا گیا، - پہلے یہ سمجھنے کے لیے کہ مقناطیسی فیلڈز شیشے کی کیپلیریوں میں ایم پیز کی حرکت کو کس طرح متاثر کرتے ہیں، اور پھر زندہ ایئر ویز.سطح.ایم پی کا سائز 0.25 سے 18 µm تک مختلف ہوتا ہے اور یہ مختلف مواد سے بنایا گیا ہے (ٹیبل 1 دیکھیں)، لیکن ایم پی میں مقناطیسی ذرات کے سائز سمیت ہر نمونے کی ساخت نامعلوم ہے۔ہمارے وسیع MCT مطالعات 19, 20, 21, 23, 24 کی بنیاد پر، ہم توقع کرتے ہیں کہ 5 µm تک کے ایم پیز کو ٹریچیل ایئر وے کی سطح پر دیکھا جا سکتا ہے، مثال کے طور پر، MP کی نقل و حرکت کی بہتر مرئیت کو دیکھنے کے لیے لگاتار فریموں کو گھٹا کر۔0.25 µm کا ایک MP امیجنگ ڈیوائس کے ریزولوشن سے چھوٹا ہے، لیکن PB-PCXI سے ان کے حجمی تضاد اور سطح کے مائع کی حرکت کا پتہ لگانے کی توقع کی جاتی ہے جس پر وہ جمع ہونے کے بعد جمع ہوتے ہیں۔
ٹیبل میں ہر ایم پی کے لیے نمونے۔1 کو 20 μl گلاس کیپلیریوں (ڈرمنڈ مائیکرو کیپس، PA، USA) میں 0.63 ملی میٹر کے اندرونی قطر کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔Corpuscular ذرات پانی میں دستیاب ہیں، جبکہ CombiMag کے ذرات مینوفیکچرر کے ملکیتی مائع میں دستیاب ہیں۔ہر ٹیوب نصف مائع سے بھری ہوئی ہے (تقریباً 11 µl) اور نمونے کے حامل پر رکھی گئی ہے (شکل 1 دیکھیں)۔شیشے کی کیپلیریوں کو بالترتیب امیجنگ چیمبر میں اسٹیج پر افقی طور پر رکھا گیا تھا اور مائع کے کناروں پر رکھا گیا تھا۔نایاب زمین، نیوڈیمیم، آئرن اور بوران (NdFeB) سے بنا ایک 19 ملی میٹر قطر (28 ملی میٹر لمبا) نکل شیل مقناطیس (N35، بلی نمبر LM1652، Jaycar Electronics، Australia) جس کی باقیات 1.17 T کے ساتھ منسلک تھی۔ رینڈرنگ کے دوران اپنی پوزیشن کو دور سے تبدیل کرنے کے لیے علیحدہ ٹرانسفر ٹیبل۔ایکس رے امیجنگ اس وقت شروع ہوتی ہے جب مقناطیس کو نمونے سے تقریباً 30 ملی میٹر اوپر رکھا جاتا ہے اور تصاویر 4 فریم فی سیکنڈ پر حاصل کی جاتی ہیں۔امیجنگ کے دوران، مقناطیس کو شیشے کی کیپلیری ٹیوب کے قریب لایا گیا (تقریباً 1 ملی میٹر کے فاصلے پر) اور پھر فیلڈ کی طاقت اور پوزیشن کے اثر کا اندازہ لگانے کے لیے ٹیوب کے ساتھ لے جایا گیا۔
xy نمونے کے ترجمے کے مرحلے پر شیشے کی کیپلیریوں میں MP کے نمونوں پر مشتمل ایک ان وٹرو امیجنگ سیٹ اپ۔ایکس رے بیم کا راستہ سرخ نقطے والی لکیر سے نشان زد ہے۔
ایک بار جب ایم پیز کی وٹرو مرئیت قائم ہو گئی تو، ان میں سے ایک ذیلی سیٹ کو جنگلی قسم کی خواتین وِسٹار البینو چوہوں (~ 12 ہفتے پرانا، ~ 200 جی) پر ویوو میں ٹیسٹ کیا گیا۔میڈیٹومائڈائن 0.24 ملی گرام/کلوگرام (ڈومیٹر®، زینواق، جاپان)، مڈازولم 3.2 ملی گرام/کلوگرام (ڈورمیکم®، ایسٹیلس فارما، جاپان) اور بٹورفینول 4 ملی گرام/کلوگرام (ویٹرفیل®، میجی سیکا)۔انٹراپریٹونیل انجیکشن کے ذریعہ چوہوں کو فارما (جاپان) کے مرکب سے بے ہوشی کی گئی۔اینستھیزیا کے بعد، انہیں ٹریچیا کے اردگرد کی کھال کو ہٹا کر، ایک اینڈوٹریچیل ٹیوب (ET؛ 16 Ga intravenous cannula، Terumo BCT) ڈال کر اور تھرمل بیگ پر مشتمل اپنی مرضی کے مطابق امیجنگ پلیٹ پر سوپائن پوزیشن میں ان کو متحرک کرکے امیجنگ کے لیے تیار کیا گیا۔ جسم کے درجہ حرارت کو برقرار رکھنے کے لئے.22. اس کے بعد امیجنگ پلیٹ کو امیجنگ باکس میں نمونے کے مرحلے کے ساتھ ہلکے زاویے پر منسلک کیا گیا تاکہ ایکسرے امیج پر ٹریچیا کو افقی طور پر سیدھ کیا جاسکے جیسا کہ شکل 2a میں دکھایا گیا ہے۔
(a) SPring-8 امیجنگ یونٹ میں Vivo امیجنگ سیٹ اپ میں، ایکس رے بیم کا راستہ سرخ نقطے والی لائن سے نشان زد ہے۔(b، c) ٹریچیل مقناطیس لوکلائزیشن کو دو آرتھوگونلی ماونٹڈ آئی پی کیمروں کا استعمال کرتے ہوئے دور سے انجام دیا گیا تھا۔اسکرین پر تصویر کے بائیں جانب، آپ سر کو پکڑے ہوئے تار کا لوپ اور ET ٹیوب کے اندر نصب ڈیلیوری کینولا دیکھ سکتے ہیں۔
100 μl گلاس سرنج کا استعمال کرتے ہوئے ایک ریموٹ کنٹرول سرنج پمپ سسٹم (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 نلیاں (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) سے 30 Ga سوئی کا استعمال کرتے ہوئے منسلک تھا۔اس بات کو یقینی بنانے کے لیے ٹیوب کو نشان زد کریں کہ اینڈوٹریچیل ٹیوب ڈالتے وقت ٹپ ٹریچیا میں صحیح پوزیشن میں ہے۔مائکروپمپ کا استعمال کرتے ہوئے، سرنج پلنگر کو ہٹا دیا گیا تھا اور ٹیوب کی نوک کو ایم پی کے نمونے میں ڈبو دیا گیا تھا۔بھری ہوئی ڈیلیوری ٹیوب کو پھر اینڈو ٹریچیل ٹیوب میں ڈالا گیا، جس سے ہماری متوقع لاگو مقناطیسی فیلڈ کے مضبوط ترین حصے پر ٹپ رکھی گئی۔تصویر کے حصول کو ہمارے Arduino پر مبنی ٹائمنگ باکس سے منسلک سانس کا پتہ لگانے والے کا استعمال کرتے ہوئے کنٹرول کیا گیا تھا، اور پاور لیب اور لیب چارٹ (AD Instruments، Sydney, Australia) کا استعمال کرتے ہوئے تمام سگنلز (مثلاً درجہ حرارت، سانس، شٹر اوپن/کلوز، اور امیج ایکوزیشن) ریکارڈ کیے گئے تھے۔ 22 جب امیجنگ جب ہاؤسنگ دستیاب نہیں تھی، دو IP کیمرے (Panasonic BB-SC382) ایک دوسرے کے قریب تقریباً 90° پر رکھے گئے تھے اور امیجنگ کے دوران ٹریچیا کی نسبت مقناطیس کی پوزیشن کو کنٹرول کرنے کے لیے استعمال کیے گئے تھے (شکل 2b، c)۔حرکتی نمونوں کو کم سے کم کرنے کے لیے، ٹرمینل سانس کے بہاؤ کی سطح مرتفع کے دوران فی سانس ایک تصویر حاصل کی گئی تھی۔
مقناطیس دوسرے مرحلے سے منسلک ہوتا ہے، جو امیجنگ باڈی کے باہر دور سے واقع ہو سکتا ہے۔مقناطیس کی مختلف پوزیشنوں اور کنفیگریشنز کا تجربہ کیا گیا، بشمول: ٹریچیا کے اوپر تقریباً 30° کے زاویے پر رکھا گیا (کنفیگریشنز کو شکل 2a اور 3a میں دکھایا گیا ہے)؛ایک مقناطیس جانور کے اوپر اور دوسرا نیچے، کھمبے کے ساتھ کشش کے لیے سیٹ کیا گیا ہے (شکل 3b)۔, ایک مقناطیس جانور کے اوپر اور ایک نیچے، کھمبے کے ساتھ پیچھے ہٹانے کے لیے مقرر کیا گیا ہے (شکل 3c)، اور ایک مقناطیس اوپر اور ٹریچیا پر کھڑا ہے (شکل 3d)۔جانوروں اور مقناطیس کو ترتیب دینے اور ایم پی کو ٹیسٹ کے تحت سرنج پمپ میں لوڈ کرنے کے بعد، تصاویر کے حصول پر 4 µl/sec کی شرح سے 50 µl کی خوراک فراہم کریں۔اس کے بعد مقناطیس کو تصاویر حاصل کرنا جاری رکھتے ہوئے ٹریچیا کے ساتھ یا اس کے پار آگے پیچھے منتقل کیا جاتا ہے۔
ویوو امیجنگ کے لیے مقناطیس کی ترتیب (a) تقریباً 30° کے زاویہ پر ٹریچیا کے اوپر ایک مقناطیس، (b) کشش کے لیے تشکیل شدہ دو میگنےٹ، (c) دو میگنےٹ جن کو پسپا کرنے کے لیے ترتیب دیا گیا ہے، (d) اوپر ایک مقناطیس اور اوپر کھڑا ٹریچیامبصر نے منہ سے پھیپھڑوں تک ٹریچیا کے ذریعے نیچے دیکھا اور ایکسرے کی شعاع چوہے کے بائیں جانب سے گزر کر دائیں جانب سے باہر نکل گئی۔مقناطیس کو یا تو ایئر وے کی لمبائی کے ساتھ منتقل کیا جاتا ہے یا ایکس رے بیم کی سمت میں ٹریچیا کے اوپر بائیں اور دائیں طرف۔
ہم نے سانس اور دل کی دھڑکن کے اختلاط کی عدم موجودگی میں ایئر ویز میں ذرات کی مرئیت اور رویے کا تعین کرنے کی بھی کوشش کی۔لہذا، امیجنگ پیریڈ کے اختتام پر، پینٹو باربیٹل اوور ڈوز (سومنوپینٹائل، پٹ مین-مور، واشنگٹن کراسنگ، USA؛ ~ 65 mg/kg ip) کی وجہ سے جانوروں کو انسانی طور پر خوش کیا گیا تھا۔کچھ جانوروں کو امیجنگ پلیٹ فارم پر چھوڑ دیا گیا تھا، اور سانس لینے اور دل کی دھڑکن بند ہونے کے بعد، امیجنگ کے عمل کو دہرایا گیا تھا، جس میں ایم پی کی اضافی خوراک شامل کی گئی تھی اگر کوئی ایم پی ایئر وے کی سطح پر نظر نہیں آتا تھا۔
نتیجے میں آنے والی تصاویر کو فلیٹ اور ڈارک فیلڈ کے لیے درست کیا گیا اور پھر MATLAB (R2020a، The Mathworks) میں لکھے گئے حسب ضرورت اسکرپٹ کا استعمال کرتے ہوئے ایک فلم (20 فریم فی سیکنڈ؛ 15–25 × عام رفتار سانس کی شرح پر منحصر ہے) میں جمع کیا گیا۔
ایل وی جین ویکٹر کی ترسیل کے بارے میں تمام مطالعات ایڈیلیڈ یونیورسٹی کے لیبارٹری اینیمل ریسرچ سینٹر میں کی گئیں اور اس کا مقصد SPring-8 کے تجربے کے نتائج کو استعمال کرنا تھا تاکہ یہ اندازہ لگایا جا سکے کہ آیا مقناطیسی میدان کی موجودگی میں LV-MP کی ترسیل Vivo میں جین کی منتقلی کو بڑھا سکتی ہے۔ .MF اور مقناطیسی میدان کے اثرات کا اندازہ کرنے کے لیے، جانوروں کے دو گروہوں کا علاج کیا گیا: ایک گروپ کو LV MF کے ساتھ مقناطیس کی جگہ کا انجکشن لگایا گیا تھا، اور دوسرے گروپ کو بغیر مقناطیس کے LV MF والے کنٹرول گروپ کے ساتھ انجکشن لگایا گیا تھا۔
LV جین ویکٹر پہلے بیان کردہ طریقوں 25, 26 کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے ہیں۔LacZ ویکٹر ایک جوہری لوکلائزڈ بیٹا-galactosidase جین کا اظہار کرتا ہے جو MPSV تشکیلاتی پروموٹر (LV-LacZ) کے ذریعہ چلایا جاتا ہے، جو منتقلی خلیوں میں نیلے رنگ کے رد عمل کی مصنوعات تیار کرتا ہے، جو پھیپھڑوں کے بافتوں کے محاذوں اور حصوں پر نظر آتا ہے۔ٹائٹریشن سیل کلچرز میں TU/ml میں ٹائٹر کا حساب لگانے کے لیے ہیموسائٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے LacZ- مثبت خلیوں کی تعداد کو دستی طور پر گن کر انجام دیا گیا تھا۔کیریئرز کو -80°C پر کریوپریزر کیا جاتا ہے، استعمال سے پہلے پگھلا دیا جاتا ہے، اور 1:1 کو مکس کرکے CombiMag پر پابند کیا جاتا ہے اور ڈیلیوری سے کم از کم 30 منٹ تک برف پر انکیوبیٹ کیا جاتا ہے۔
نارمل اسپراگ ڈاؤلی چوہوں (n = 3/گروپ، ~2-3 اینستھیٹائزڈ ip 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) اور 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) 1 ماہ کی عمر میں) ip ) انجیکشن اور غیر جراحی زبانی کینولیشن ایک 16 Ga انٹراوینس کینول کے ساتھ۔اس بات کو یقینی بنانے کے لیے کہ ٹریچیل ایئر وے کے ٹشو کو LV ٹرانسڈکشن موصول ہوتا ہے، اسے ہمارے پہلے بیان کردہ مکینیکل پرٹربیشن پروٹوکول کا استعمال کرتے ہوئے کنڈیشنڈ کیا گیا تھا جس میں ٹریچیل ایئر وے کی سطح کو تار کی ٹوکری کے ساتھ محوری طور پر رگڑا گیا تھا (N-Circle، Nitinol stone Extractor without tip NTSE-022115) -UDH کک میڈیکل، USA) 30 p28۔پھر، بائیو سیفٹی کیبنٹ میں گڑبڑ کے تقریباً 10 منٹ بعد، LV-MP کی ٹریچیل ایڈمنسٹریشن کی گئی۔
اس تجربے میں استعمال ہونے والے مقناطیسی فیلڈ کو ویوو ایکس رے اسٹڈی کی طرح ترتیب دیا گیا تھا، اسی طرح کے میگنےٹ ڈسٹلیشن اسٹینٹ کلیمپس (شکل 4) کے ساتھ ٹریچیا پر رکھے ہوئے تھے۔LV-MP کا 50 µl حجم (2 x 25 µl aliquots) جیل ٹپڈ پپیٹ کا استعمال کرتے ہوئے ٹریچیا (n = 3 جانوروں) کو پہنچایا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔کنٹرول گروپ (n = 3 جانوروں) نے مقناطیس کے استعمال کے بغیر ایک ہی LV-MP حاصل کیا۔انفیوژن کی تکمیل کے بعد، کینول کو اینڈوٹریچیل ٹیوب سے ہٹا دیا جاتا ہے اور جانور کو نکال دیا جاتا ہے۔مقناطیس ہٹانے سے پہلے 10 منٹ تک اپنی جگہ پر رہتا ہے۔چوہوں کو meloxicam (1 ml/kg) (Ilium، Australia) کے ساتھ subcutaneously dosed کیا گیا تھا جس کے بعد 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia) کے انٹراپریٹونیئل انجیکشن کے ذریعے اینستھیزیا کی واپسی کی گئی تھی۔اینستھیزیا سے مکمل صحت یابی تک چوہوں کو گرم رکھا گیا اور مشاہدہ کیا گیا۔
حیاتیاتی حفاظتی کابینہ میں LV-MP کی ترسیل کا آلہ۔آپ دیکھ سکتے ہیں کہ ET ٹیوب کی ہلکی بھوری رنگ کی Luer-lock آستین منہ سے باہر نکلتی ہے، اور تصویر میں دکھایا گیا جیل پائپیٹ ٹپ ET ٹیوب کے ذریعے ٹریچیا میں مطلوبہ گہرائی تک داخل کیا جاتا ہے۔
LV-MP انتظامیہ کے طریقہ کار کے ایک ہفتے بعد، جانوروں کو 100% CO2 کی سانس کے ذریعے انسانی طور پر قربان کیا گیا اور ہمارے معیاری X-gal علاج کا استعمال کرتے ہوئے LacZ اظہار کا اندازہ لگایا گیا۔تین سب سے زیادہ کاڈل کارٹلیج کے حلقے اس بات کو یقینی بنانے کے لیے ہٹا دیے گئے تھے کہ اینڈو ٹریچیل ٹیوب پلیسمنٹ کی وجہ سے کوئی میکانکی نقصان یا سیال برقرار رکھنے کو تجزیہ میں شامل نہیں کیا جائے گا۔تجزیہ کے لیے دو حصوں کو حاصل کرنے کے لیے ہر ٹریچیا کو لمبائی کی طرف کاٹ کر ایک کپ میں رکھا گیا تھا جس میں سلیکون ربڑ (سلگارڈ، ڈاؤ انک) پر مشتمل ایک منٹیئن سوئی (فائن سائنس ٹولز) کا استعمال کرتے ہوئے luminal سطح کا تصور کیا گیا تھا۔منتقلی خلیوں کی تقسیم اور کردار کی تصدیق ایک DigiLite کیمرہ اور TCapture سافٹ ویئر (Tucsen Photonics، China) کے ساتھ Nikon مائکروسکوپ (SMZ1500) کا استعمال کرتے ہوئے فرنٹل فوٹو گرافی سے ہوئی۔تصاویر کو 20x میگنیفیکیشن پر حاصل کیا گیا تھا (بشمول ٹریچیا کی پوری چوڑائی کے لیے زیادہ سے زیادہ ترتیب)، ٹریچیا کی پوری لمبائی قدم بہ قدم ظاہر ہوتی ہے، ہر تصویر کے درمیان کافی اوورلیپ فراہم کرتی ہے تاکہ تصاویر کو "سلائی" جاسکے۔اس کے بعد پلانر موشن الگورتھم کا استعمال کرتے ہوئے کمپوزٹ امیج ایڈیٹر ورژن 2.0.3 (مائیکروسافٹ ریسرچ) کا استعمال کرتے ہوئے ہر ٹریچیا کی تصاویر کو ایک ہی کمپوزٹ امیج میں جوڑ دیا گیا۔ 0.35 < ہیو < 0.58، سنترپتی> 0.15، اور قدر < 0.7 کی ترتیبات کا استعمال کرتے ہوئے، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، ہر جانور کی ٹریچیل کمپوزٹ امیجز کے اندر LacZ اظہار کے رقبے کو ایک خودکار MATLAB اسکرپٹ (R2020a، MathWorks) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیا گیا۔ 0.35 < ہیو < 0.58، سنترپتی> 0.15، اور قدر < 0.7 کی ترتیبات کا استعمال کرتے ہوئے، جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے، ہر جانور کی ٹریچیل کمپوزٹ امیجز کے اندر LacZ اظہار کے رقبے کو ایک خودکار MATLAB اسکرپٹ (R2020a، MathWorks) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیا گیا۔ Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7۔ ہر جانور کی جامع ٹریچیل امیجز میں LacZ اظہار کے رقبے کو ایک خودکار MATLAB اسکرپٹ (R2020a، MathWorks) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا تھا 28 0.35 کی ترتیبات کا استعمال کرتے ہوئے0.15 اور قدر <0 .7۔如 前所 ， 使用 自动 自动 matlab 脚本 （r2020a ， ریاضی کے کام） 对 每 只 只 动物 的 气管 复合 复合 中 的 Lacz 表达 进行 进行 量化 量化 ， ， 0.35 <色调 <0.58 、 饱和度> 0.15 和值 <0.15 的 <0.15 的 的 的 设置 设置 设置如 前所 ， 自动 自动 自动 Matlab 脚本 （（（R2020A ， ریاضی کے کام） 来自 只 的 的 气管 复合 图像 图像 的 的 的 量化 量化 使用 使用 使用 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.15 的 <0.15 的 < ....... ....... ....... Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . ہر جانور کی ٹریچیا کی جامع تصاویر پر LacZ اظہار کے علاقوں کو ایک خودکار MATLAB اسکرپٹ (R2020a، MathWorks) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کیا گیا جیسا کہ پہلے 0.35 < hue < 0.58، saturation > 0.15 اور قدر < 0.7 کی ترتیبات کا استعمال کرتے ہوئے بیان کیا گیا تھا۔GIMP v2.10.24 میں بافتوں کی شکلوں کا سراغ لگاتے ہوئے، ہر ایک جامع تصویر کے لیے ایک ماسک دستی طور پر بنایا گیا تھا تاکہ ٹشو کے علاقے کی شناخت کی جا سکے اور ٹریچیل ٹشو کے باہر کسی بھی قسم کی غلط شناخت کو روکا جا سکے۔ہر جانور کی تمام جامع امیجز کے داغ والے علاقوں کا خلاصہ اس جانور کے لیے کل داغ دار علاقہ دینے کے لیے کیا گیا تھا۔اس کے بعد پینٹ شدہ ایریا کو ماسک کے کل رقبے سے تقسیم کیا گیا تاکہ نارمل ایریا حاصل کیا جا سکے۔
ہر ٹریچیا پیرافین میں سرایت کی گئی تھی اور 5 µm موٹی سیکشن کی گئی تھی۔سیکشنز کو 5 منٹ کے لیے غیر جانبدار فاسٹ ریڈ کے ساتھ کاؤنٹر سٹین کیا گیا اور Nikon Eclipse E400 مائکروسکوپ، DS-Fi3 کیمرہ اور NIS عنصر کیپچر سافٹ ویئر (ورژن 5.20.00) کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں۔
تمام شماریاتی تجزیے GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) میں کیے گئے تھے۔شماریاتی اہمیت p ≤ 0.05 پر رکھی گئی تھی۔شاپیرو-ولک ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے معمول کی جانچ کی گئی اور غیر جوڑی والے ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے LacZ داغ میں فرق کا اندازہ کیا گیا۔
ٹیبل 1 میں بیان کردہ چھ ایم پیز کی جانچ پی سی ایکس آئی نے کی تھی، اور مرئیت کو ٹیبل 2 میں بیان کیا گیا ہے۔ دو پولی اسٹیرین ایم پی (MP1 اور MP2؛ 18 µm اور 0.25 µm، بالترتیب) PCXI کے ذریعے نظر نہیں آئے تھے، لیکن بقیہ نمونوں کی شناخت کی جا سکتی تھی۔ (مثالیں شکل 5 میں دکھائی گئی ہیں)۔MP3 اور MP4 کمزور طور پر دکھائی دے رہے ہیں (10-15% Fe3O4؛ 0.25 µm اور 0.9 µm، بالترتیب)۔اگرچہ MP5 (98% Fe3O4؛ 0.25 µm) میں ٹیسٹ کیے گئے کچھ چھوٹے ذرات شامل تھے، لیکن یہ سب سے زیادہ واضح تھا۔CombiMag MP6 پروڈکٹ میں فرق کرنا مشکل ہے۔تمام صورتوں میں، کیپلیری کے متوازی مقناطیس کو آگے پیچھے منتقل کرکے MFs کا پتہ لگانے کی ہماری صلاحیت کو بہت بہتر بنایا گیا تھا۔جیسے جیسے میگنےٹ کیپلیری سے دور ہوتے گئے، ذرات کو لمبی زنجیروں میں کھینچ لیا گیا، لیکن جیسے جیسے میگنےٹ قریب آتے گئے اور مقناطیسی میدان کی طاقت بڑھتی گئی، ذرات کیپلیری کی اوپری سطح کی طرف منتقل ہونے کے ساتھ ہی ذرہ کی زنجیریں مختصر ہوتی گئیں (ضمیمہ ویڈیو S1 دیکھیں۔ : MP4)، سطح پر ذرہ کثافت میں اضافہ۔اس کے برعکس، جب مقناطیس کو کیپلیری سے ہٹا دیا جاتا ہے، تو فیلڈ کی طاقت کم ہو جاتی ہے اور ایم پیز کیپلیری کی اوپری سطح سے پھیلی ہوئی لمبی زنجیروں میں دوبارہ ترتیب دیتے ہیں (دیکھیں ضمنی ویڈیو S2: MP4)۔مقناطیس کی حرکت بند ہونے کے بعد، ذرات توازن کی پوزیشن پر پہنچنے کے بعد کچھ دیر تک حرکت کرتے رہتے ہیں۔جیسا کہ ایم پی کیپلیری کی اوپری سطح کی طرف اور دور ہوتا ہے، مقناطیسی ذرات مائع کے ذریعے ملبہ کھینچتے ہیں۔
PCXI کے تحت MP کی مرئیت نمونوں کے درمیان کافی حد تک مختلف ہوتی ہے۔(a) MP3، (b) MP4، (c) MP5 اور (d) MP6۔یہاں دکھائی جانے والی تمام تصاویر ایک مقناطیس کے ساتھ لی گئی ہیں جو تقریباً 10 ملی میٹر کیپلیری کے اوپر واقع ہے۔ظاہری بڑے دائرے کیپلیریوں میں پھنسے ہوئے ہوا کے بلبلے ہیں، جو واضح طور پر مرحلے کے برعکس تصویر کے سیاہ اور سفید کنارے کی خصوصیات کو ظاہر کرتے ہیں۔سرخ باکس اس اضافہ کی نشاندہی کرتا ہے جو اس کے برعکس کو بڑھاتا ہے۔نوٹ کریں کہ تمام اعداد و شمار میں مقناطیسی سرکٹس کا قطر پیمانہ نہیں ہے اور دکھائے گئے سے تقریباً 100 گنا بڑا ہے۔
جیسے ہی مقناطیس کیپلیری کے اوپری حصے کے ساتھ بائیں اور دائیں حرکت کرتا ہے، ایم پی سٹرنگ کا زاویہ مقناطیس کے ساتھ سیدھ میں بدل جاتا ہے (شکل 6 دیکھیں)، اس طرح مقناطیسی فیلڈ لائنوں کی وضاحت ہوتی ہے۔MP3-5 کے لیے، راگ دہلیز کے زاویے تک پہنچنے کے بعد، ذرات کیپلیری کی اوپری سطح کے ساتھ گھسیٹتے ہیں۔اس کے نتیجے میں اکثر ایم پیز بڑے گروپوں میں جمع ہوجاتے ہیں جہاں مقناطیسی فیلڈ سب سے زیادہ مضبوط ہوتا ہے (دیکھیں ضمنی ویڈیو S3: MP5)۔یہ خاص طور پر اس وقت بھی واضح ہوتا ہے جب کیپلیری کے اختتام کے قریب امیجنگ کی جاتی ہے، جس کی وجہ سے ایم پی مائع ہوا کے انٹرفیس پر جمع اور توجہ مرکوز کرتا ہے۔MP6 میں موجود ذرات، جو MP3-5 کے مقابلے میں تمیز کرنا مشکل تھے، جب مقناطیس کیپلیری کے ساتھ منتقل ہوتا ہے تو وہ نہیں گھسیٹتے تھے، لیکن MP سٹرنگز الگ ہو جاتے ہیں، جس سے ذرات نظر میں رہتے ہیں (ضمنی ویڈیو S4: MP6 دیکھیں)۔بعض صورتوں میں، جب مقناطیس کو امیجنگ سائٹ سے کافی فاصلے پر منتقل کر کے لاگو مقناطیسی فیلڈ کو کم کر دیا گیا، تو کوئی بھی باقی ماندہ ایم پی آہستہ آہستہ کشش ثقل کے ذریعے ٹیوب کی نچلی سطح پر اترا، تار میں باقی رہ گیا (ضمنی ویڈیو S5: MP3 دیکھیں) .
ایم پی سٹرنگ کا زاویہ تبدیل ہوتا ہے کیونکہ مقناطیس کیپلیری کے اوپر دائیں طرف جاتا ہے۔(a) MP3، (b) MP4، (c) MP5 اور (d) MP6۔سرخ باکس اس اضافہ کی نشاندہی کرتا ہے جو اس کے برعکس کو بڑھاتا ہے۔براہ کرم نوٹ کریں کہ اضافی ویڈیوز معلوماتی مقاصد کے لیے ہیں کیونکہ وہ اہم ذرہ ساخت اور متحرک معلومات کو ظاہر کرتے ہیں جو ان جامد تصاویر میں نہیں دیکھی جا سکتیں۔
ہمارے ٹیسٹوں سے معلوم ہوا ہے کہ ٹریچیا کے ساتھ مقناطیس کو آہستہ آہستہ آگے پیچھے کرنا Vivo میں پیچیدہ حرکت کے تناظر میں MF کے تصور کو آسان بناتا ہے۔کوئی ان ویوو ٹیسٹ نہیں کیا گیا کیونکہ پولی اسٹیرین موتیوں کی مالا (MP1 اور MP2) کیپلیری میں دکھائی نہیں دے رہے تھے۔بقیہ چار MFs میں سے ہر ایک کا تجربہ ویوو میں مقناطیس کے لمبے محور کے ساتھ کیا گیا تھا جو ٹریچیا کے اوپر تقریباً 30° کے زاویہ پر عمودی (دیکھیں اعداد و شمار 2b اور 3a)، کیونکہ اس کے نتیجے میں MF کی زنجیریں لمبی ہوئیں اور زیادہ موثر تھیں۔ ایک مقناطیس کے مقابلے میں..ترتیب ختمMP3، MP4 اور MP6 کسی بھی زندہ جانور کی ٹریچیا میں نہیں پائے گئے ہیں۔انسانی طور پر جانوروں کو مارنے کے بعد چوہوں کی سانس کی نالی کا تصور کرتے وقت، ذرات پوشیدہ رہے یہاں تک کہ جب سرنج پمپ کا استعمال کرتے ہوئے اضافی حجم شامل کیا گیا ہو۔MP5 میں آئرن آکسائیڈ کا مواد سب سے زیادہ تھا اور یہ واحد نظر آنے والا ذرہ تھا، اس لیے اسے Vivo میں MP کے رویے کا اندازہ لگانے اور اس کی خصوصیت کے لیے استعمال کیا جاتا تھا۔
MF داخل کرنے کے دوران trachea پر مقناطیس کی جگہ کے نتیجے میں بہت سے، لیکن تمام نہیں، MFs کو منظر کے میدان میں مرکوز کیا گیا ہے۔ذرات کی ٹریچیل انٹری کو انسانی طور پر ایتھنائزڈ جانوروں میں بہترین طور پر دیکھا جاتا ہے۔شکل 7 اور ضمنی ویڈیو S6: MP5 وینٹرل ٹریچیا کی سطح پر ذرات کی تیزی سے مقناطیسی گرفت اور سیدھ کو دکھاتا ہے، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ایم پیز کو ٹریچیا کے مطلوبہ علاقوں کو نشانہ بنایا جا سکتا ہے۔جب MF کی ترسیل کے بعد ٹریچیا کے ساتھ زیادہ دور تلاش کیا گیا تو، کچھ MFs کیرینا کے قریب پائے گئے، جو تمام MFs کو جمع کرنے اور رکھنے کے لیے ناکافی مقناطیسی فیلڈ کی طاقت کی نشاندہی کرتا ہے، کیونکہ وہ سیال کی انتظامیہ کے دوران زیادہ سے زیادہ مقناطیسی فیلڈ کی طاقت کے علاقے میں پہنچائے گئے تھے۔عملتاہم، بعد از پیدائش ایم پی کا ارتکاز امیج ایریا کے ارد گرد زیادہ تھا، جس سے پتہ چلتا ہے کہ بہت سے ایم پیز ایئر وے والے علاقوں میں رہے جہاں لاگو مقناطیسی فیلڈ کی طاقت سب سے زیادہ تھی۔
(a) اس سے پہلے اور (b) ایم پی 5 کی ترسیل کے بعد کی تصاویر حال ہی میں یوتھانائزڈ چوہے کی ٹریچیا میں ایک مقناطیس کے ساتھ امیجنگ ایریا کے بالکل اوپر رکھا گیا ہے۔دکھایا گیا علاقہ دو کارٹیلجینس حلقوں کے درمیان واقع ہے۔ایم پی ڈیلیور ہونے سے پہلے ایئر ویز میں کچھ سیال ہوتا ہے۔سرخ باکس اس اضافہ کی نشاندہی کرتا ہے جو اس کے برعکس کو بڑھاتا ہے۔یہ تصاویر S6: MP5 سپلیمنٹری ویڈیو میں شامل ویڈیو سے لی گئی ہیں۔
ویوو میں ٹریچیا کے ساتھ مقناطیس کو منتقل کرنے کے نتیجے میں ایئر وے کی سطح پر ایم پی چین کے زاویہ میں تبدیلی آئی، جیسا کہ کیپلیریوں میں دیکھا گیا ہے (شکل 8 اور ضمنی ویڈیو S7: MP5 دیکھیں)۔تاہم، ہمارے مطالعے میں، اراکین پارلیمنٹ کو زندہ سانس کی نالیوں کی سطح کے ساتھ نہیں گھسیٹا جا سکتا تھا، جیسا کہ کیپلیریاں کر سکتی ہیں۔بعض صورتوں میں، ایم پی چین لمبا ہو جاتا ہے کیونکہ مقناطیس بائیں اور دائیں حرکت کرتا ہے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ہم نے یہ بھی پایا کہ جب مقناطیس کو ٹریچیا کے ساتھ طول بلد میں منتقل کیا جاتا ہے تو پارٹیکل چین سیال کی سطح کی تہہ کی گہرائی کو تبدیل کرتا ہے، اور جب مقناطیس کو براہ راست اوپر لے جایا جاتا ہے اور ذرہ کی زنجیر کو عمودی پوزیشن میں گھمایا جاتا ہے تو اس میں توسیع ہوتی ہے۔ ضمنی ویڈیو S7)۔: MP5 پر 0:09، نیچے دائیں)۔جب مقناطیس کو ٹریچیا کے اوپری حصے میں (یعنی ٹریچیا کی لمبائی کے بجائے جانور کے بائیں یا دائیں طرف) منتقل کیا گیا تو خصوصیت کی نقل و حرکت کا نمونہ بدل گیا۔ذرات اپنی حرکت کے دوران اب بھی واضح طور پر دکھائی دے رہے تھے، لیکن جب مقناطیس کو ٹریچیا سے ہٹایا گیا تو ذرہ کے تاروں کی نوکیں نظر آنے لگیں (دیکھیں ضمنی ویڈیو S8: MP5، شروع ہونے والی 0:08)۔یہ شیشے کی کیپلیری میں لاگو مقناطیسی میدان کے عمل کے تحت مقناطیسی میدان کے مشاہدہ شدہ رویے سے متفق ہے۔
زندہ بے ہوشی والے چوہے کی ٹریچیا میں MP5 کی نمونہ تصاویر۔(a) مقناطیس کو ٹریچیا کے اوپر اور بائیں طرف کی تصاویر حاصل کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، پھر (b) مقناطیس کو دائیں طرف منتقل کرنے کے بعد۔سرخ باکس اس اضافہ کی نشاندہی کرتا ہے جو اس کے برعکس کو بڑھاتا ہے۔یہ تصاویر S7 کی سپلیمنٹری ویڈیو: MP5 میں نمایاں کردہ ویڈیو کی ہیں۔
جب دونوں قطبوں کو ٹریچیا کے اوپر اور نیچے شمال-جنوب کی سمت میں ٹیون کیا گیا تھا (یعنی متوجہ ہونا؛ تصویر 3b)، MP chords لمبے لمبے نمودار ہوئے اور ٹریچیا کی پس منظر کی دیوار پر واقع تھے ٹریچیا (ملاحظہ کریں ضمیمہ)۔ویڈیو S9:MP5)۔تاہم، ایک جگہ پر ذرات کی زیادہ تعداد (یعنی ٹریچیا کی ڈورسل سطح) کو دوہری مقناطیس ڈیوائس کا استعمال کرتے ہوئے سیال انتظامیہ کے بعد پتہ نہیں چلا، جو عام طور پر ایک مقناطیسی ڈیوائس کے ساتھ ہوتا ہے۔پھر، جب ایک مقناطیس کو مخالف قطبوں کو پیچھے ہٹانے کے لیے ترتیب دیا گیا تھا (شکل 3c)، منظر کے میدان میں نظر آنے والے ذرات کی تعداد ڈیلیوری کے بعد نہیں بڑھی۔مقناطیسی فیلڈ کی اعلی طاقت کی وجہ سے دونوں مقناطیسی ترتیبوں کو ترتیب دینا مشکل ہے جو بالترتیب مقناطیس کو اپنی طرف متوجہ یا دھکیلتا ہے۔اس کے بعد سیٹ اپ کو ایئر ویز کے متوازی واحد مقناطیس میں تبدیل کر دیا گیا لیکن 90 ڈگری کے زاویے پر ایئر ویز سے گزرنا تاکہ قوت کی لکیریں ٹریچیل دیوار کو آرتھوگونی طور پر پار کر جائیں (شکل 3d)، ایک سمت جس کا مقصد ذرّات کے جمع ہونے کے امکان کا تعین کرنا تھا۔ پس منظر کی دیوار.مشاہدہ کیا جائےتاہم، اس ترتیب میں، کوئی قابل شناخت MF جمع کرنے والی حرکت یا مقناطیس کی حرکت نہیں تھی۔ان تمام نتائج کی بنیاد پر، جین کیریئرز کے ویوو اسٹڈیز (تصویر 3a) کے لیے سنگل مقناطیس اور 30 ​​ڈگری واقفیت کے ساتھ ایک ترتیب کا انتخاب کیا گیا۔
جب جانور کو انسانی طور پر قربان کیے جانے کے فوراً بعد متعدد بار تصویر کشی کی گئی تو ٹشو کی حرکت میں مداخلت نہ ہونے کا مطلب یہ تھا کہ مقناطیس کی ترجمے کی حرکت کے مطابق واضح انٹرکارٹیلجینس فیلڈ میں باریک، چھوٹی ذرات کی لکیروں کو دیکھا جا سکتا ہے۔MP6 ذرات کی موجودگی اور نقل و حرکت کو واضح طور پر دیکھیں۔
LV-LacZ کا ٹائٹر 1.8 x 108 IU/mL تھا، اور CombiMag MP (MP6) کے ساتھ 1:1 ملانے کے بعد، جانوروں کو LV گاڑی کی 9 x 107 IU/ml کی 50 µl tracheal خوراک (یعنی 4.5) کے ساتھ انجکشن لگایا گیا تھا۔ x 106 TU/چوہا)۔)۔ان مطالعات میں، مشقت کے دوران مقناطیس کو حرکت دینے کے بجائے، ہم نے مقناطیس کو ایک پوزیشن میں طے کیا تاکہ یہ معلوم کیا جا سکے کہ آیا LV کی نقل و حمل (a) مقناطیسی میدان کی عدم موجودگی میں ویکٹر کی ترسیل کے مقابلے میں بہتر ہو سکتی ہے، اور (b) اگر ہوا کا راستہ توجہ مرکوز کریں.خلیات اوپری سانس کی نالی کے مقناطیسی ہدف والے علاقوں میں منتقل ہو رہے ہیں۔
میگنےٹ کی موجودگی اور LV ویکٹر کے ساتھ CombiMag کا استعمال جانوروں کی صحت پر منفی اثر نہیں ڈالتا، جیسا کہ ہمارے معیاری LV ویکٹر ڈیلیوری پروٹوکول نے کیا تھا۔ٹریچیل ریجن کی سامنے والی تصاویر جو میکانیکی ہنگامہ آرائی کا شکار ہیں (ضمنی شکل 1) سے پتہ چلتا ہے کہ LV-MP کے علاج شدہ گروپ میں مقناطیس (تصویر 9a) کی موجودگی میں نقل و حمل کی سطح نمایاں طور پر زیادہ تھی۔کنٹرول گروپ (شکل 9b) میں نیلے رنگ کے LacZ داغ کی صرف ایک چھوٹی سی مقدار موجود تھی۔X-Gal-stained normalized خطوں کی مقدار سے پتہ چلتا ہے کہ LV-MP کی مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں انتظامیہ کے نتیجے میں تقریباً 6 گنا بہتری آئی (تصویر 9c)۔
LV-MP (a) مقناطیسی میدان کی موجودگی میں اور (b) مقناطیس کی غیر موجودگی میں tracheal transduction کو دکھانے والی جامع تصاویر کی مثال۔(c) مقناطیس کے استعمال سے ٹریچیا میں LacZ ٹرانزیکشن کے نارملائزڈ ایریا میں شماریاتی طور پر نمایاں بہتری (*p = 0.029، t-ٹیسٹ، n = 3 فی گروپ، اوسط کی ± معیاری غلطی)۔
غیر جانبدار تیز سرخ داغ والے حصے (مثال کے طور پر ضمنی شکل 2 میں دکھایا گیا ہے) نے اشارہ کیا کہ LacZ کے داغ والے خلیے ایک ہی نمونے میں اور اسی جگہ پر موجود تھے جیسا کہ پہلے بتایا گیا تھا۔
ایئر وے جین تھراپی میں اہم چیلنج دلچسپی کے علاقوں میں کیریئر کے ذرات کی درست لوکلائزیشن اور ہوا کے بہاؤ اور فعال بلغم کی صفائی کی موجودگی میں موبائل پھیپھڑوں میں نقل و حمل کی کارکردگی کی اعلی سطح کا حصول ہے۔سسٹک فائبروسس میں سانس کی بیماریوں کے علاج کے لیے بنائے گئے LV کیریئرز کے لیے، کنڈکٹیو ایئر ویز میں کیریئر کے ذرات کے قیام کے وقت کو بڑھانا اب تک ایک ناقابل حصول مقصد رہا ہے۔جیسا کہ Castellani et al. کی طرف سے اشارہ کیا گیا ہے، نقل و حمل کو بڑھانے کے لیے مقناطیسی میدانوں کے استعمال کے دوسرے جین کی ترسیل کے طریقوں جیسے الیکٹروپوریشن کے مقابلے میں فوائد ہیں کیونکہ یہ سادگی، معیشت، مقامی ترسیل، کارکردگی میں اضافہ، اور کم انکیوبیشن وقت کو یکجا کر سکتا ہے۔اور ممکنہ طور پر گاڑی10 کی کم خوراک۔تاہم، Vivo میں بیرونی مقناطیسی قوتوں کے زیر اثر ہوا کی نالیوں میں مقناطیسی ذرات کے جمع ہونے اور برتاؤ کو کبھی بیان نہیں کیا گیا ہے، اور درحقیقت اس طریقے کی قابلیت کو زندہ رہنے والی ایئر ویز میں جین کے اظہار کی سطح کو بڑھانے کے لیے Vivo میں ظاہر نہیں کیا گیا ہے۔
PCXI synchrotron پر ہمارے ان وٹرو تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ ایم پی پولی اسٹیرین کے استثناء کے ساتھ، ہم نے جن ذرات کا تجربہ کیا، وہ امیجنگ سیٹ اپ میں دکھائی دے رہے تھے۔مقناطیسی میدان کی موجودگی میں، مقناطیسی میدان تار بناتے ہیں، جن کی لمبائی کا تعلق ذرات کی قسم اور مقناطیسی میدان کی طاقت (یعنی مقناطیس کی قربت اور حرکت) سے ہوتا ہے۔جیسا کہ شکل 10 میں دکھایا گیا ہے، ہم جن تاروں کا مشاہدہ کرتے ہیں وہ اس وقت بنتے ہیں جب ہر انفرادی ذرہ مقناطیسی ہو جاتا ہے اور اس کے اپنے مقامی مقناطیسی میدان کو آمادہ کرتا ہے۔یہ الگ الگ فیلڈز دوسرے ذرّات کو جمع کرنے اور گروپ سٹرنگ حرکات کے ساتھ جڑنے کا سبب بنتے ہیں جس کی وجہ سے مقامی قوتوں کی طرف سے مقامی قوتوں کی کشش اور دوسرے ذرات کو پسپا کرتے ہیں۔
خاکہ دکھا رہا ہے (a, b) ذرات کی زنجیریں جو سیال سے بھری کیپلیریوں کے اندر بنتی ہیں اور (c, d) ہوا سے بھری ٹریچیا۔نوٹ کریں کہ کیپلیریاں اور ٹریچیا پیمانے پر نہیں کھینچے جاتے ہیں۔پینل (a) میں زنجیروں میں ترتیب دیئے گئے Fe3O4 ذرات پر مشتمل MF کی تفصیل بھی شامل ہے۔
جب مقناطیس کیپلیری کے اوپر چلا گیا، تو پارٹیکل سٹرنگ کا زاویہ MP3-5 کے لیے Fe3O4 پر مشتمل نازک حد تک پہنچ گیا، جس کے بعد پارٹیکل سٹرنگ اپنی اصل پوزیشن میں نہیں رہی، بلکہ سطح کے ساتھ ساتھ ایک نئی پوزیشن پر چلی گئی۔مقناطیسیہ اثر ممکنہ طور پر ہوتا ہے کیونکہ شیشے کی کیپلیری کی سطح اتنی ہموار ہے کہ اس حرکت کو ہونے کی اجازت دے سکے۔دلچسپ بات یہ ہے کہ MP6 (CombiMag) نے اس طرح برتاؤ نہیں کیا، شاید اس لیے کہ ذرات چھوٹے تھے، ان کی کوٹنگ یا سطح کا چارج مختلف تھا، یا ملکیتی کیریئر سیال نے ان کی حرکت کرنے کی صلاحیت کو متاثر کیا۔CombiMag پارٹیکل امیج میں کنٹراسٹ بھی کمزور ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ مائع اور ذرات کی کثافت ایک جیسی ہو سکتی ہے اور اس لیے آسانی سے ایک دوسرے کی طرف نہیں بڑھ سکتے۔اگر مقناطیس بہت تیزی سے حرکت کرتا ہے تو ذرات بھی پھنس سکتے ہیں، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ مقناطیسی میدان کی طاقت ہمیشہ سیال میں موجود ذرات کے درمیان رگڑ پر قابو نہیں پا سکتی، تجویز کرتی ہے کہ مقناطیسی میدان کی طاقت اور مقناطیس اور ہدف کے علاقے کے درمیان فاصلہ نہیں ہونا چاہیے۔ حیرتاہمیہ نتائج یہ بھی بتاتے ہیں کہ اگرچہ میگنےٹ ٹارگٹ ایریا میں بہنے والے بہت سے مائکرو پارٹیکلز کو پکڑ سکتے ہیں، لیکن اس بات کا امکان نہیں ہے کہ میگنےٹ کو CombiMag کے ذرات کو ٹریچیا کی سطح کے ساتھ منتقل کرنے کے لیے انحصار کیا جائے۔اس طرح، ہم نے یہ نتیجہ اخذ کیا کہ Vivo LV MF اسٹڈیز میں جامد مقناطیسی فیلڈز کو جسمانی طور پر ایئر وے کے درخت کے مخصوص علاقوں کو نشانہ بنانے کے لیے استعمال کرنا چاہیے۔
ایک بار جب ذرات جسم میں پہنچ جاتے ہیں، تو جسم کے پیچیدہ متحرک بافتوں کے تناظر میں ان کی شناخت مشکل ہو جاتی ہے، لیکن ایم پی کے تاروں کو "مگل" کرنے کے لیے مقناطیس کو ٹریچیا کے اوپر افقی طور پر منتقل کر کے ان کی کھوج کی صلاحیت کو بہتر بنایا گیا ہے۔اگرچہ حقیقی وقت کی امیجنگ ممکن ہے، جانور کے انسانی طور پر مارے جانے کے بعد ذرات کی حرکت کو سمجھنا آسان ہے۔اس مقام پر ایم پی کا ارتکاز عام طور پر سب سے زیادہ ہوتا تھا جب مقناطیس کو امیجنگ ایریا پر رکھا جاتا تھا، حالانکہ کچھ ذرات عام طور پر ٹریچیا کے نیچے پائے جاتے تھے۔وٹرو اسٹڈیز کے برعکس، ذرات کو مقناطیس کی حرکت سے ٹریچیا کے نیچے نہیں گھسیٹا جا سکتا۔یہ دریافت اس بات سے مطابقت رکھتی ہے کہ بلغم جو ٹریچیا کی سطح کو ڈھانپتا ہے عام طور پر سانس کے ذرات پر کارروائی کرتا ہے، انہیں بلغم میں پھنستا ہے اور بعد میں انہیں میوکو سلیری کلیئرنس میکانزم کے ذریعے صاف کرتا ہے۔
ہم نے قیاس کیا کہ کشش (تصویر 3b) کے لیے ٹریچیا کے اوپر اور نیچے میگنےٹ استعمال کرنے کے نتیجے میں زیادہ یکساں مقناطیسی میدان پیدا ہو سکتا ہے، بجائے اس کے کہ ایک مقناطیسی میدان جو ایک نقطہ پر بہت زیادہ مرتکز ہو، ممکنہ طور پر ذرات کی زیادہ یکساں تقسیم کے نتیجے میں۔.تاہم، ہمارے ابتدائی مطالعہ میں اس مفروضے کی حمایت کرنے کے لیے واضح ثبوت نہیں ملے۔اسی طرح، میگنےٹ کے ایک جوڑے کو پیچھے ہٹانے کے لیے ترتیب دینے سے (تصویر 3c) تصویر کے علاقے میں زیادہ ذرہ جمنے کا نتیجہ نہیں نکلا۔یہ دونوں نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ دوہری مقناطیسی سیٹ اپ ایم پی پوائنٹنگ کے مقامی کنٹرول کو نمایاں طور پر بہتر نہیں کرتا ہے، اور اس کے نتیجے میں مضبوط مقناطیسی قوتوں کو ٹیون کرنا مشکل ہے، جس سے یہ نقطہ نظر کم عملی ہو جاتا ہے۔اسی طرح، ٹریچیا (شکل 3d) کے اوپر اور اس کے پار مقناطیس کو سمت دینے سے بھی امیج والے حصے میں باقی ذرات کی تعداد میں اضافہ نہیں ہوا۔ان میں سے کچھ متبادل کنفیگریشنز کامیاب نہیں ہو سکتی ہیں کیونکہ ان کے نتیجے میں جمع ہونے والے زون میں مقناطیسی میدان کی طاقت میں کمی واقع ہوتی ہے۔اس طرح، 30 ڈگری (تصویر 3a) پر سنگل میگنیٹ کنفیگریشن کو ویوو ٹیسٹنگ کے طریقہ کار میں سب سے آسان اور موثر سمجھا جاتا ہے۔
LV-MP مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ جب LV ویکٹر کو CombiMag کے ساتھ ملایا گیا اور مقناطیسی فیلڈ کی موجودگی میں جسمانی طور پر پریشان ہونے کے بعد پہنچایا گیا، تو کنٹرول کے مقابلے ٹریچیا میں نقل و حمل کی سطح نمایاں طور پر بڑھ گئی۔سنکروٹرون امیجنگ اسٹڈیز اور LacZ کے نتائج کی بنیاد پر، مقناطیسی میدان LV کو ٹریچیا میں رکھنے اور پھیپھڑوں میں فوری طور پر گہرائی میں داخل ہونے والے ویکٹر ذرات کی تعداد کو کم کرنے کے قابل دکھائی دیتا ہے۔اس طرح کی اہدافی بہتری اعلی کارکردگی کا باعث بن سکتی ہے جبکہ ڈیلیور شدہ ٹائٹرز، غیر ٹارگٹڈ ٹرانزیکشن، سوزش اور مدافعتی ضمنی اثرات، اور جین کی منتقلی کے اخراجات کو کم کرتے ہیں۔اہم بات یہ ہے کہ مینوفیکچرر کے مطابق، CombiMag کو دیگر جین کی منتقلی کے طریقوں کے ساتھ مل کر استعمال کیا جا سکتا ہے، بشمول دیگر وائرل ویکٹر (جیسے AAV) اور نیوکلک ایسڈ۔