Giardia duodenum ایک پرجیوی جاندار ہے جو giardiasis کا سبب بنتا ہے، ایک آنتوں کا انفیکشن خاص طور پر چھوٹے بچوں میں اسہال کی طبی علامات کے ساتھ عام ہے۔ہم نے پہلے اطلاع دی ہے کہ ایکسٹرا سیلولر G. duodenalis intracellular oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) بائنڈنگ نیوکلیوٹائڈس کو متحرک کرتا ہے اور ایکسٹرا سیلولر ویسیکل (EV) سراو کے ذریعے میزبان سوزش کے ردعمل کو منظم کرتا ہے۔تاہم، اس عمل میں شامل پیتھوجین سے وابستہ ڈوڈینوکوکل ای وی (جی ای وی) کے صحیح سالماتی نمونوں اور جیارڈیاسس میں این ایل آر پی 3 سوزش کے کردار کو واضح کرنا باقی ہے۔
GEV میں ریکومبیننٹ یوکرائیوٹک ایکسپریشن پلازمیڈ pcDNA3.1(+)-alpha-2 اور alpha-7.3 giardins کی تعمیر کی گئی، ماؤس پرائمری پیریٹونیل میکروفیجز میں منتقلی کی گئی، اور سوزش کے ہدف مالیکیول کیسپیس -1 کی پیمائش کرکے پتہ چلا۔p20 اظہار کی سطح کی اسکریننگ کی گئی۔.G. duodenalis alpha-2 اور alpha-7.3 giardines کی شناخت اصل میں NLRP3 inflammasome (NLRP3، pro-interleukin-1 beta [IL-1β]، pro-caspase-1 اور caspase-1 p20)، IL سراو کی پیمائش کے ذریعے کی گئی تھی۔1β کی سطح، اپوپٹوٹک سپاٹڈ پروٹین (ASC) اولیگومرائزیشن لیولز، اور NLRP3 اور ASC کی امیونو فلوروسینٹ لوکلائزیشن۔G. duodenalis کی روگجنکیت میں NLRP3 سوزش کے کردار کا جائزہ پھر چوہوں کا استعمال کرتے ہوئے لگایا گیا جس میں NLRP3 ایکٹیویشن کو بلاک کیا گیا تھا (NLRP3 بلاک شدہ چوہوں) اور جسمانی وزن میں پیتھولوجیکل تبدیلیاں، گرہنی پرجیوی بوجھ، اور گرہنی کے ٹشو کی نگرانی کی گئی۔اس کے علاوہ، ہم نے اس بات کی تحقیقات کی کہ آیا hiardines alpha-2 اور alpha-7.3 NLRP3 سوزش کے ذریعے Vivo میں IL-1β کے اخراج کو دلاتے ہیں اور چوہوں میں G. duodenalis کی روگجنکیت میں ان مالیکیولز کے کردار کا تعین کرتے ہیں۔
Alpha-2 اور alpha-7.3 giardines وٹرو میں NLRP3 سوزش کو چالو کرنے کی حوصلہ افزائی کرتے ہیں۔اس کی وجہ سے p20 caspase-1 کی ایکٹیویشن ہوئی، NLRP3، pro-IL-1β، اور pro-caspase-1 پروٹین کے اظہار کی سطح میں اضافہ، IL-1β سراو میں نمایاں اضافہ، ASA کے دھبوں کی تشکیل۔ سائٹوپلازم، اور ASA oligomerization کی شمولیت۔NLRP3 کی سوزش پیناائل کا نقصان چوہوں میں G. duodenalis کی روگجنکیت کو بڑھا دیتا ہے۔NLRP3 بلاک شدہ چوہوں سے گیویج کے ذریعے سسٹوں کے ساتھ علاج کیے گئے چوہوں نے ٹرافوزائیٹس کی بڑھتی ہوئی تعداد اور گرہنی والی ولی کو شدید نقصان کا مظاہرہ کیا، جس کی خصوصیت سکڑ اور شاخوں کے ساتھ نیکروٹک کریپٹس ہے۔Vivo میں تجربات سے پتہ چلتا ہے کہ giardines alpha-2 اور alpha-7.3 NLRP3 سوزش کے ذریعے IL-1β کی رطوبت پیدا کر سکتے ہیں، اور giardines alpha-2 اور alpha-7.3 کے ساتھ حفاظتی ٹیکوں نے چوہوں میں G. duodenalis کی روگجنکیت کو کم کیا۔
اس مطالعے کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ giardia alpha-2 اور alpha-7.3 میزبان NLRP3 کی سوزش کو بڑھاتے ہیں اور چوہوں میں G. duodenalis کی انفیکشن کو کم کرتے ہیں، جو giardiasis کو روکنے کے لیے امید افزا اہداف ہیں۔
Giardia duodenum ایک ماورائے خلوی پروٹوزوآن پرجیوی ہے جو چھوٹی آنت میں رہتا ہے اور سالانہ 280 ملین کیس اسہال کے ساتھ giardiasis کا سبب بنتا ہے، خاص طور پر ترقی پذیر ممالک میں چھوٹے بچوں میں [1]۔لوگ پینے کے پانی یا M. duodenum cysts سے آلودہ کھانے سے متاثر ہوتے ہیں، جو پھر معدے میں داخل ہوتے ہیں اور گیسٹرک جوس میں خارج ہوتے ہیں۔Giardia duodenum trophozoites گرہنی کے اپکلا سے منسلک ہوتے ہیں، جس سے متلی، الٹی، اسہال، پیٹ میں درد، اور وزن میں کمی ہوتی ہے۔امیونو ڈیفیشینسی اور سسٹک فائبروسس والے افراد انفیکشن کے لیے حساس ہوتے ہیں۔انفیکشن زبانی اور مقعد جنسی کے ذریعے بھی ہوسکتا ہے [2]۔دوائیاں جیسے کہ میٹرو نیڈازول، ٹینیڈازول، اور نائٹازوکسانائیڈ گرہنی کے انفیکشن کے لیے ترجیحی علاج کے اختیارات ہیں [3]۔تاہم، یہ کیموتھراپی ادویات منفی ضمنی اثرات کا باعث بنتی ہیں جیسے متلی، سرطان پیدا کرنے اور جینوٹوکسٹی [4]۔لہذا، G. duodenalis انفیکشن کو روکنے کے لیے مزید موثر حکمت عملی تیار کرنے کی ضرورت ہے۔
Inflammasomes سائٹوسولک پروٹین کمپلیکس کا ایک طبقہ ہے جو فطری مدافعتی ردعمل کا حصہ ہے، جو روگزن کے حملے کے خلاف دفاع کرنے میں مدد کرتا ہے اور اشتعال انگیز ردعمل میں ثالثی کرتا ہے [5]۔ان سوزشوں میں سے، نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ اولیگومرائزیشن (این او ڈی) ریسیپٹر 3 (NLRP3) نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ اولیگومرائزیشن (NLRP3) نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ نما سوزش کا بڑے پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے کیونکہ اس کا پتہ مختلف پیتھوجین/موکلر پیٹرن کے ذریعے لگایا جا سکتا ہے۔ ڈی اے ایم پی)، پیدائشی مدافعتی نظام کو پہچانتا، فعال کرتا ہے۔اور بہت سے سوزش کی بیماریوں میں آنتوں کے ہومیوسٹاسس کو منظم کرتا ہے [6,7,8]۔یہ پیٹرن ریکگنیشن ریسیپٹر (PRR) NLRP3، ایک اڈاپٹر اپوپٹوٹک اسپاٹڈ پروٹین (ASC)، اور ایک انفیکٹر پروکاسپیس-1 یا پروکاسپیس-11 پر مشتمل ہے۔NLRP3 سوزش پیتھوجین کے حملے کے خلاف ایک میزبان کے طور پر کام کرتا ہے، جیسا کہ نیوسپورا کینینم [9]، پیراکوکسیڈیوڈس بریسیلینسس [10]، اور لیشمانیا کے مطالعے میں مشاہدہ کیا گیا ہے۔[11]، لیکن یہ بھی بتایا گیا ہے کہ این ایل آر پی 3 کی سوزش کو چالو کرنا حفاظتی مدافعتی ردعمل کو محدود کرتا ہے اور بیماری کے بڑھنے کو بڑھاتا ہے، مثال کے طور پر، کیڑے میں [12]۔ہماری پچھلی دریافتوں کی بنیاد پر، ہم نے رپورٹ کیا کہ ایکسٹرا سیلولر G. duodenalis NLRP3 سوزش کی انٹرا سیلولر ایکٹیویشن کو متحرک کرتا ہے اور ایکسٹرا سیلولر ویسیکلز (EVs) کو خفیہ کرکے میزبان سوزش کے ردعمل کو ماڈیول کرتا ہے [13]۔تاہم، Vivo میں G. duodenalis انفیکشن میں NLRP3 سوزش کے کردار کا تعین ہونا باقی ہے۔
Giardins کو اصل میں G. duodenalis cytoskeleton کے ساختی اجزاء کے طور پر بیان کیا گیا تھا اور چھوٹی آنت میں trophozoite حرکت پذیری اور اپیتھیلیل سیل منسلکہ میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ماحول کو بہتر طریقے سے ڈھالنے اور اپنی روگجنکیت کو بڑھانے کے لیے، G. duodenalis trophozoites نے ایک منفرد سائٹوسکیلیٹل ڈھانچہ تیار کیا جس میں 8 فلاجیلا، 1 درمیانی جسم، اور 1 وینٹرل ڈسک [14] پر مشتمل تھا۔Giardia duodenum کے trophozoites اپنے cytoskeleton کو اوپری چھوٹی آنت میں گھسنے کے لیے استعمال کرتے ہیں، خاص طور پر گرہنی میں، اور انٹروسائٹس سے منسلک ہوتے ہیں۔وہ سیل میٹابولزم کا استعمال کرتے ہوئے مسلسل ہجرت کرتے ہیں اور اپکلا خلیوں سے منسلک ہوتے ہیں۔لہذا، ان کے cytoskeleton اور virulence کے درمیان قریبی تعلق ہے.Giardia duodenum کے لیے مخصوص Giardines cytoskeleton ڈھانچے کے اجزاء ہیں [15] اور انہیں چار کلاسوں میں تقسیم کیا گیا ہے: α-, β-, γ-، اور δ-giardines۔α-giardin خاندان کے 21 ارکان ہیں، جن میں سے سبھی میں فاسفولیپڈز [16] کو باندھنے کی کیلشیم پر منحصر صلاحیت ہے۔وہ cytoskeleton کو سیل جھلی سے بھی جوڑتے ہیں۔G. duodenalis کی وجہ سے ہونے والے اسہال والے افراد میں، α-giardins انفیکشن کے دوران بہت زیادہ اظہار اور مدافعتی ہوتے ہیں [17]۔Giardia alfa-1 پر مبنی ہیٹرولوگس ویکسین چوہوں میں giardiasis کے خلاف محفوظ ہیں اور ویکسین کی نشوونما کے لیے ممکنہ امیدوار اینٹیجنز ہیں [18]۔Alpha-8 giardin، پلازما جھلی اور فلاجیلا میں مقامی ہے، لیکن وینٹرل ڈسک میں نہیں، G. duodenalis [19] میں trophozoites کی حرکت پذیری اور ترقی کی شرح کو بڑھاتا ہے۔Alpha-14 giardin flagella پر مائکرو ٹیوبول ڈھانچے سے منسلک ہوتا ہے اور G. duodenalis [20] کی عملداری کو متاثر کرتا ہے۔Alpha-11 giardine پوری زندگی کے دوران وافر مقدار میں موجود ہے، اور Alpha-11 giardine کی زیادہ کارکردگی خود G. duodenalis کو نقصان پہنچاتی ہے [21]۔تاہم، یہ واضح نہیں ہے کہ آیا alpha-2 giardine اور alpha-7.3 giardine G. duodenalis انفیکشن اور ان کے بنیادی میکانزم کے خلاف حفاظتی ہیں۔
اس مطالعے میں، recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine اور pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine کو میزبان NLRP3 کو چالو کرنے کے لیے ماؤس پرائمری پیریٹونیئل میکروفیجز میں تبدیل کیا گیا۔اس کے بعد سوزش کے اہداف کی اسکریننگ کی گئی۔ہم نے G. duodenalis کی روگجنکیت میں NLRP3 سوزش کے کردار کا بھی جائزہ لیا، اس بات کی تحقیق کی کہ آیا الفا-2 اور الفا-7,3 giardines Vivo میں NLRP3 سوزش کو چالو کرنے کا باعث بنتے ہیں، اور طے کیا کہ روگجنکیت میں giardines کے یہ دو کردار G. duodenalis.ہمارا مشترکہ مقصد G. duodenalis انفیکشن کی روک تھام کے لیے امید افزا اہداف تیار کرنا تھا۔
وائلڈ ٹائپ (WT) C57BL/6 مادہ چوہے جن کی عمر 5-8 ہفتے تھی لیاؤننگ چانگ شینگ تجرباتی جانوروں کے مرکز (لیاؤننگ، چین) سے خریدی گئی تھی۔چوہوں کو پانی تک مفت رسائی حاصل تھی، انہیں جراثیم سے پاک کھانا ملا اور انہیں 12/12 گھنٹے روشنی/اندھیرے کے چکر میں رکھا گیا۔انفیکشن سے پہلے، چوہوں نے پینے کے پانی میں اینٹی بائیوٹکس ایڈ لیبٹم حاصل کی جس میں ایمپسلن (1 ملی گرام/ملی لیٹر)، وینکومائسن (1 ملی گرام/ملی لیٹر)، اور نیومائسن (1.4 ملی گرام/ملی لیٹر) (تمام شنگھائی، چین، مصنوعی جانداروں سے خریدے گئے) [22] ]]وہ چوہے جو 24 گھنٹے سے زیادہ کھانے پینے کی صلاحیت کھو چکے تھے اور ≥ 20% جسمانی وزن کم کر چکے تھے وہ گریوا کی نقل مکانی کی وجہ سے انسانی طور پر خوش ہو گئے تھے۔
WB G. duodenalis trophozoites (امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن، ماناساس، USA) کو 12.5% ​​فیٹل بوائین سیرم (FBS؛ ایوری گرین، Zhejiang، China) اور 0.1% بوائین بائل (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) کے ساتھ ضمیمہ کیا گیا تھا۔ )۔USA) مائکرو ایروبک حالات میں۔سنگم ٹرافوزائیٹس کو برف پر جمع کیا گیا اور مزید تولید کے لیے 1:4 کے تناسب سے گزر گیا۔
Giardia duodenum cysts کی حوصلہ افزائی کی گئی جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [23]، ٹرافوزائیٹس کو لوگاریتھمک مرحلے میں کاٹا گیا اور پھر انکیپسولیشن انڈیوسنگ میڈیم، پی ایچ 7.1 (تبدیل شدہ TYI-S-33) کے ساتھ 1 × 106 ٹروفوزائٹس کی حتمی حراستی میں پتلا کیا گیا۔پت کا ارتکاز 0.05% درمیانہ)۔ٹروفوزائٹس کو انیروبک حالات میں 37 ° C پر لوگاریتھمک ترقی کے مرحلے تک مہذب کیا گیا تھا۔میڈیم کو سسٹ انڈیوسنگ میڈیم میں تبدیل کریں (pH 7.8؛ ترمیم شدہ TYI-S-33 میڈیم 1% بائل ارتکاز کے ساتھ) اور کلچر G. duodenalis کو 37°C پر 48-96 گھنٹے کے لیے، جس کے دوران سسٹوں کی تشکیل کو ایک خوردبین کے نیچے دیکھا گیا۔زیادہ تر ٹرافوزائیٹس کو سسٹ بنانے کی ترغیب دینے کے بعد، کلچر کے مرکب کی کٹائی کی گئی اور اسے جراثیم سے پاک ڈیونائزڈ پانی میں دوبارہ پھینک دیا گیا تاکہ بقیہ ٹرافوزائیٹس کو لیس کیا جا سکے۔چوہوں میں گیسٹرک ٹیوب کے ذریعے بعد کے تجزیوں کے لیے سسٹس کو 4 ° C پر شمار کیا گیا اور ذخیرہ کیا گیا۔
Giardia extracellular vesicles (GEVs) کو افزودہ کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [13]۔لوگاریتھمک نمو کے مرحلے میں ٹرافوزائیٹس کو تبدیل شدہ TYI-S-33 میڈیم میں دوبارہ معطل کیا گیا تھا جو exosome-depleted FBS (حیاتیاتی صنعتوں، Beit-Haemek، اسرائیل) کے ساتھ 1 × 106 پرجیویوں/mL کے حتمی ارتکاز میں تیار کیا گیا تھا اور 12 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔10 منٹ کے لیے 2000 گرام، 45 منٹ کے لیے 10,000 جی، اور 60 منٹ کے لیے 100,000 جی پر سینٹرفیوگریشن کے ذریعے کلچر سپرنٹنٹ سے الگ تھلگ کیا گیا تھا۔فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں پریسیپیٹیٹس کو تحلیل کیا گیا، BCA پروٹین پرکھ کٹ (تھرمو فشر سائنٹیفک، والتھم، MA، USA) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی اور -80° C. پر ذخیرہ کیا گیا یا مزید تجزیوں کے لیے براہ راست استعمال کیا گیا۔
پرائمری ماؤس پیریٹونیل میکروفیج تیار کیے گئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [24]۔مختصراً، چوہوں (6-8 ہفتوں کی عمر) کو 2.5 ملی لیٹر 2.98% Difco مائع تھیوگلائکول میڈیم (BD، فرینکلن لیکس، NJ، USA) کے ساتھ انجکشن لگایا گیا اور 3-4 تالو کھلائے گئے۔یوتھناسیا کے بعد چوہوں کے پیٹ کی گہا سے میکروفیجز کا ایک معطلی جمع کیا گیا تھا اور 10 منٹ کے لئے 1000 جی پر 3 بار سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔CD11b مارکر کا استعمال کرتے ہوئے فلو سائٹومیٹری کے ذریعے کٹے ہوئے خلیات کا پتہ لگایا گیا جب تک کہ سیل کی پاکیزگی>98% نہ ہو، پھر 6 کنویں سیل کلچر پلیٹس (4.5 x 106 سیل/کنواں) میں شامل کیا گیا اور 37°C پر 10% FBS (بائیو انڈسٹری) کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا۔اور 5% CO2۔
آر این اے کو 1 × 107 ٹرافوزائیٹس سے 1 ملی لیٹر TRIzol ریجنٹ (Vazyme، Nanjing، China) میں نکالا گیا تھا، جینومک DNA کو کل G. duodenalis RNA سے MonScript dsDNase (موناد، ووہان، چین) کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا تھا اور تکمیلی DNA (مطابقت پذیر) مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق MonScript RTIIII سپر مکس (Monad) کا استعمال۔
ہدف G. duodenalis جین کے لیے CDS کی ترتیب کی معلومات NCBI GenBank سے حاصل کی گئی تھی۔ہر ٹارگٹ جین کے لیے مخصوص ہموار کلوننگ پرائمر ڈیزائن کرنے کے لیے پرائمر 5.0 استعمال کریں۔فارورڈ پرائمر (5′-3′) تین حصوں پر مشتمل ہے: ایک لکیری ویکٹر pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) کے ساتھ ایک اوورلیپنگ ترتیب اور کوڈنز ATG اور GNN شروع کریں (اگر پہلا بیس G نہیں ہے)۔یہ اظہار کی کارکردگی کو بہتر بنانے کے لیے کیا جاتا ہے۔اس کے علاوہ، کم از کم 16 bp مشترکہ اڈے (GC مواد 40–60%/Tm تقریباً 55 °C)۔ریورس پرائمر (5′-3′) دو حصوں پر مشتمل ہوتا ہے، EcoRV-linearized ویکٹر pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) کے ساتھ ایک اوور لیپنگ ترتیب اور کم از کم 16 bp کی مشترکہ بنیاد۔(آخری دو اسٹاپس کو چھوڑ کر)۔بیسز) ایک کوڈن جیسے AA یا GA تاکہ دوبارہ پیدا ہونے والے پلازمیڈ کو ان کے لیبل لگے ہوئے پروٹین کا اظہار کرنے کی اجازت دی جاسکے)۔پرائمر کی ترتیب جدول 1 میں درج ہیں اور انہیں کانگمیٹ بائیوٹیکنالوجی کمپنی لمیٹڈ (چانگچن، چین) نے ترکیب کیا تھا۔
Pfu DNA پولیمریز (Tiangen, Beijing, China) یا Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) کو بطور ٹیمپلیٹ تیار کردہ G. duodenalis cDNA کا استعمال کرتے ہوئے اہداف کو بڑھا دیا گیا۔یوکرائیوٹک ایکسپریشن ویکٹر پلاسمڈ pcDNA3.1(+) کو پابندی والے انزائم EcoRV کے ساتھ لکیریائز کیا گیا تھا اور فاسٹ اے پی (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیفاسفوریلیٹ کیا گیا تھا۔لائنرائزڈ پی سی ڈی این اے 3.1 (+) کے ٹکڑوں اور ایمپلیفائیڈ ٹارگٹ جین کے ٹکڑوں کو ڈی این اے جیل پیوریفیکیشن کٹ (ٹیانجن) کا استعمال کرتے ہوئے پاک کیا گیا اور نانوڈراپ این ڈی-2000 (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔pcDNA3.1(+) ٹکڑا اور ہر ٹارگٹ جین کے ٹکڑے کو MonClone سنگل اسمبلی کلوننگ مکس (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) کا استعمال کرتے ہوئے دوبارہ ملایا گیا اور Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China) کا استعمال کرتے ہوئے DNA کی ترتیب سے تصدیق کی گئی۔.
Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 اور pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیے گئے تھے۔ارتکاز کو 500 ng/µl سے اوپر برقرار رکھا گیا تھا تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ elution بفر میں EDTA ٹرانسفیکشن پرکھ میں مداخلت نہ کرے۔پرائمری ماؤس پیریٹونیل میکروفیجز کو 6 کنویں پلیٹوں میں مکمل RPMI 1640 میڈیم (بائیولوجیکل انڈسٹریز) کے ساتھ 12 گھنٹے تک کلچر کیا گیا، پھر پینسلن اور سٹریپٹومائسن کو ہٹانے کے لیے سیلز کو گرم پی بی ایس میں 3 بار دھویا گیا، اور پھر درمیانے درجے میں مکمل میڈیم کے ساتھ مکمل کیا گیا۔اینڈوٹوکسین فری پلازمیڈز pcDNA3.1(+)-alpha-2 اور pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) کو Opti-MEM کے 125 μl میں گھٹا دیا گیا سیرم میڈیم (Gibco, Thermo Fisher Scientific)۔.پھر 5 µl Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific) کو 125 µl کم سیرم Opti-MEM میڈیم میں پتلا کیا گیا۔لیپوسوم-ڈی این اے کمپلیکس کو لیپوفیکٹامین 2000 کے ساتھ ملا کر اور اس مرکب کو کمرے کے درجہ حرارت پر 5 منٹ تک کھڑا رہنے کی اجازت دے کر انڈوٹوکسن فری پلاسمڈ کو ملا کر تیار کریں۔کمپلیکس کو الگ الگ ہر کنویں کے خلیوں میں منتقل کریں اور آہستہ آہستہ مکس کریں۔4 گھنٹے کے بعد، سیل کلچر میڈیم کو 2 ملی لیٹر مکمل RPMI 1640 میڈیم سے تبدیل کیا گیا اور کلچر کو 24 گھنٹے جاری رکھا گیا۔تازہ سیل کلچر میڈیم کو خلیوں میں شامل کیا گیا تھا اور پرکھ کے ڈیزائن کے لحاظ سے مختلف ٹائم پوائنٹس کے لئے انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔
سپرنٹنٹس اور سیل لائسیٹس سے پروٹین کے نمونے تیار کیے گئے تھے جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [25]۔پرو-IL-1β، pro-caspase-1، caspase-1 p20، NLRP3، β-actin، اور His-tag کے لیے جھلی کی منتقلی کے پیرامیٹرز 200 mA/90 منٹ تھے۔interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) اور NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) اور 1:5000 کے لیے اس کے ٹیگ کو نشانہ بناتے ہوئے (Amylet Scientific, Amylet Scientific) ووہان، چین) اور β-ایکٹین (پروٹینٹیک، ووہان، چین)۔
ڈسکینیمائڈ سبیریٹ (DSS) کے ساتھ کراس لنکنگ انجام دیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے [26]۔سیلز کو کولڈ پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا اور 50 μl ASC ری ایکشن بفر (pH 8.0) میں 27 گیج سوئی سے مکمل طور پر لیس کیا گیا جس میں 25 mM Na2PO4، 187.5 mM NaCl، 25 mM HEPES اور 125 mM NaHCO3 شامل ہیں۔مرکب کو 3 منٹ کے لیے 5000 جی پر سینٹرفیوج کیا گیا تھا اور گولی کو 10 µl DSS (DMSO میں 25 mM) اور 40 µl ASC رد عمل بفر کے ساتھ 30 منٹ کے لیے 37 ° C پر سیون کیا گیا تھا۔10 منٹ کے لیے 5000 جی پر سینٹرفیوگریشن کے بعد، گولی کو ASC ری ایکشن بفر کے 40 µl اور 6x پروٹین لوڈنگ بفر کے 10 µl (TransGen، بیجنگ، چین) کے محلول میں تحلیل کیا گیا، اور پھر اس محلول کو کمرے کے درجہ حرارت پر 15 تک بجھایا گیا۔ منٹ، پھر 10 منٹ ابالیں۔اس کے بعد پروٹین کے نمونوں کو پرائمری اینٹی اے ایس سی اینٹی باڈیز (وانلیبیو، شینیانگ، چین) کا استعمال کرتے ہوئے 1:500 کے کم ہونے کے تناسب سے مغربی بلوٹنگ کا نشانہ بنایا گیا۔
پہلے بیان کردہ طریقہ کار [13] کے بعد، سیل کلچر سپرنٹنٹس کی کٹائی کی گئی اور ماؤس IL-1 بیٹا ELISA کٹ (انویٹروجن، تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے سوزش والی سائٹوکائن IL-1β کے سراو کا تعین کیا گیا۔IL-1β معیاری منحنی خطوط کا استعمال کرتے ہوئے OD450nm قدروں کو پروٹین کے ارتکاز میں تبدیل کریں۔
کور سلپس پر لیپت سیلز کو گرم پی بی ایس میں 3 بار آہستہ سے دھویا گیا، ٹشو سیل فکسیٹیو (بائیوشارپ، بیجنگ، چین) میں کمرے کے درجہ حرارت (RT) پر 10 منٹ کے لیے فکس کیا گیا، 0.1% Triton X-Permeabilize میں 100 (PBS میں پتلا؛ Biosharp) ) 20 منٹ کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر اور 5% بوائین سیرم البومین (PBS میں) کمرے کے درجہ حرارت پر 2 گھنٹے کے لیے بلاک کریں۔اس کے بعد خلیات کو راتوں رات 4 ° C پر پرائمری اینٹی باڈیز کے ساتھ ASC (1:100 dilution) یا NLRP3 (1:100 dilution) کے خلاف بالترتیب سینک دیا جاتا تھا، اور Cy3 کا لیبل بکری اینٹی خرگوش IgG(H+L) (1:400؛ EarthOx) تھا۔ , San Francisco, CA, USA) یا FITC- conjugated goat anti-mouse IgG (1:400; Earthox) رات بھر اندھیرے میں 37°C پر 1 گھنٹے تک۔نیوکلی کو Hoechst 33258 (10 μg/ml؛ UE، Suzhou، China) سے 5 منٹ تک داغ دیا گیا اور فلوروسینس مائکروسکوپ (اولمپس کارپوریشن، ٹوکیو، جاپان) کے تحت مشاہدہ کیا گیا۔
چوہوں کو چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا (ہر گروپ میں n = 7): (i) PBS سے علاج شدہ منفی کنٹرول گروپ (صرف PBS؛ gavage 100 µl/mous PBS جس کے بعد روزانہ intraperitoneal انجکشن 100 µl/mouse PBS 3 گھنٹے بعد)۔مسلسل 7 دن تک)(ii) منفی کنٹرول گروپ MCC950 inhibitor [27] کے ساتھ علاج کیا گیا (100 µl/mouse by PBS gavage، 3 گھنٹے بعد، 10 mg/kg جسمانی وزن [BW] MCC950 [PBS میں] روزانہ انٹراپریٹونی طور پر دیا گیا، دورانیہ 7 دن)؛(iii) G. duodenalis cyst انفیکشن گروپ (1.5 x 106 cysts/mouse by gavage, 3 گھنٹے بعد, 100 μl/mous PBS intraperitoneally 7 دن تک روزانہ دیا جاتا ہے)(iv) G. duodenalis cyst مشترکہ انفیکشن گروپ MCC950 inhibitor علاج گروپ (1.5×106 cysts/mouse through gavage, 10mg/kg جسمانی وزن MCC950 intraperitoneally 7 دن کے لیے روزانہ 3h پر)۔ہر ماؤس کے جسمانی وزن کی روزانہ نگرانی کی جاتی تھی اور 7ویں دن تمام چوہوں کو موت کے گھاٹ اتار دیا جاتا تھا۔کٹے ہوئے گرہنی (3 سینٹی میٹر لمبے) کو 1 ملی لیٹر پی بی ایس میں چھوٹے ٹکڑوں میں کاٹا گیا تھا، پی بی ایس میں 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر راتوں رات سسٹوں کو تباہ کر دیا گیا تھا، اور جی ڈوڈینالس ٹرافوزائٹس۔تازہ گرہنی (1 سینٹی میٹر لمبا) ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) داغ لگانے کے لئے الگ تھلگ تھا۔
چوہوں کو دو گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: (i) MOCK کنٹرول گروپ اور (ii) MCC950 inhibitor گروپ۔ہر گروپ میں پانچ علاج تھے (n = 7/علاج گروپ): (i) پی بی ایس ٹریٹمنٹ منفی کنٹرول گروپ (صرف پی بی ایس؛ 100 μl/ماؤس پی بی ایس، انٹرماسکلر (آئی ایم) انجیکشن (ٹیبیلیس اینٹریئر) [28، 29] ؛( ii) pcDNA3.1(+) پلاسمڈ منفی کنٹرول گروپ (100 µg/mouse DNA, intramuscular injection کے ذریعے) (iii) G. duodenalis cyst انفیکشن مثبت کنٹرول گروپ (1.5 x 106 cysts/mous, through gavage) (iv) a گروپ کا علاج پلازمیڈ pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/mouse DNA، intramuscular انجیکشن کے ذریعے)، اور (v) ایک گروپ جس کا علاج پلازمڈ pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/mouse) سے کیا گیا ڈی این اے، 12 گھنٹے گزرنے کے بعد، MCC950 inhibitor گروپ میں چوہوں کو MCC950 (10 mg/kg جسمانی وزن) کا روزانہ انٹراپریٹونیل انجکشن 7 دنوں تک ملا، جبکہ MOCK گروپ کے چوہوں کو PBS کے علاج کے مساوی مقدار میں خون کے نمونے ملے۔ آئی بالز چوہوں سے اکٹھا کیا گیا اور 4 ° C پر رات بھر چھوڑ دیا گیا سیرم کے نمونے IL-1β کی سطح کے لئے انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کا استعمال کرتے ہوئے الگ تھلگ کیے گئے تھے۔
پینتیس چوہوں کو پانچ گروپوں (n = 7/گروپ) میں تقسیم کیا گیا تھا۔گروپ 1 ایک منفی کنٹرول گروپ تھا جس کا علاج پی بی ایس کے ساتھ کیا گیا تھا: چوہوں کو 100 μl پی بی ایس انٹرماسکلر طور پر اور 3 دن بعد گیویج کے ذریعہ موصول ہوا۔گروپ 2 ایک مثبت کنٹرول گروپ ہے جو G. duodenalis cysts سے متاثر ہے: چوہوں کو 100 μl PBS کے ساتھ انجکشن لگایا گیا تھا، اور 3 دن بعد 1.5 x 106 cysts/ماؤس کو intragastrically انجکشن لگایا گیا تھا۔تیسرا گروپ - دوڈینل سسٹ انفیکشن کے کنٹرول گروپ کے ساتھ pcDNA3.1(+) کے ساتھ پلاسمیڈ امیونائزیشن: چوہوں نے 100 μg پلازمڈ DNA pcDNA3.1(+)(im) زبانی طور پر حاصل کیا، کئی کے لیے 1.5×106 سسٹ/ماؤس 3 دن۔گروپ 4 اور 5 G. duodenalis cyst انفیکشن کے ساتھ مل کر پی سی ڈی این اے 3.1(+)-الفا-2 جیارڈائن پلاسمیڈ یا pcDNA3.1(+)-الفا-7.3 جیارڈائن پلاسمیڈ تھے۔تجرباتی گروپ: چوہوں نے 100 µg pcDNA3 حاصل کیا۔1(+)-giardine plasmid DNA (im)، پھر 3 دن بعد، 1.5 × 106 cysts/mouse کو gavage کے ذریعے انجکشن لگایا گیا۔ٹیوب کے ذریعے G. duodenalis cyst کے تعارف کے بعد ہر ماؤس کے جسمانی وزن کی نگرانی کی گئی۔پرجیوی بوجھ کی پیمائش اور ایچ ای داغدار تجزیہ کے لئے تازہ گرہنی جمع کیا گیا تھا۔
ہسٹوپیتھولوجیکل تبدیلیوں کا تجزیہ پہلے شائع شدہ طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا [30]۔تازہ گرہنی کو ٹشو سیل فکسیٹیو کے ساتھ طے کیا گیا تھا، پیرافین میں سرایت کیا گیا تھا، 4 μm حصوں میں کاٹا گیا تھا، H&E سے داغ دیا گیا تھا اور ہلکے خوردبین کے نیچے تجزیہ کیا گیا تھا۔سات آزاد چوہوں کے سات ٹشو سیکشنز میں نمائندہ پیتھولوجیکل تبدیلیوں کا اندازہ ایک پیتھالوجسٹ کے ذریعہ کیا گیا جو علاج سے بے خبر تھا اور اسے 200x میگنیفیکیشن پر پکڑا گیا۔ولی کی لمبائی اور کریپٹس کی گہرائی کو پہلے بیان کردہ طریقوں کے مطابق ناپا گیا۔
وٹرو اور ان ویوو میں نتائج سہ رخی میں حاصل کیے گئے۔گراف پیڈ پرزم 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) کا استعمال کرتے ہوئے گراف بنائے گئے تھے۔دو گروپوں کے درمیان اختلافات کا تجزیہ t-ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا تھا، جبکہ ≥3 گروپوں کے درمیان فرق کا تجزیہ SPSS سافٹ ویئر (ورژن 22.0؛ SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) کا استعمال کرتے ہوئے تغیر (ANOVA) کے یک طرفہ تجزیہ سے کیا گیا تھا۔لیون کے ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے تغیر کی یکسانیت کے لیے ڈیٹا کا تجزیہ کیا گیا جس کے بعد بونفیرونی کے پوسٹ ہاک ٹیسٹ (B) کا استعمال کیا گیا۔اہمیت کو P <0.05، P <0.01، اور P <0.001 (اہم نہیں [ns]) (P>0.05) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
کیوٹو انسائیکلوپیڈیا آف جینز اینڈ جینومز (KEGG) میں GEV پروٹومکس کے ہمارے پچھلے تجزیے سے معلوم ہوا کہ اشتعال انگیز سگنلنگ راستوں کو چالو کرنے میں بہت سے اہداف شامل ہو سکتے ہیں [13]۔ہم نے دو امید افزا اہداف کا انتخاب کیا، الفا-2 اور الفا-7.3 جارڈینز، ان مالیکیولز کو بڑھاتے ہیں اور انہیں pcDNA3.1(+) یوکرائیوٹک ایکسپریشن ویکٹر بنانے کے لیے استعمال کرتے ہیں۔ترتیب دینے کے بعد، recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 اور alpha-7.3 giardine expression plasmids کو بنیادی ماؤس peritoneal macrophages میں تبدیل کر دیا گیا، اور سوزش کے کیسپیس-1 p20 سگنیچر پروٹین (ایکٹیویٹڈ کیسپیس-1 کا ایک ٹکڑا) کی شناخت کی گئی۔ کلیدی مالیکیولز کو واضح کرنے کے طور پر جو سوزش کو متحرک کرسکتے ہیں۔نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ الفا -2 اور الفا -7.3 جیارڈائنز جی ای وی کی طرح p20 کیسپیس -1 اظہار پیدا کرسکتے ہیں۔غیر علاج شدہ منفی کنٹرول (صرف پی بی ایس) اور پلازمیڈ کنٹرول پی سی ڈی این اے 3.1 (+) (شکل 1) میں کیسپیس 1 ایکٹیویشن پر کوئی اثر نہیں پایا گیا۔
pcDNA3.1(+)-alpha-2 اور alpha-7.3 giardins کے ذریعے p20 caspase-1 ایکٹیویشن کی پیمائش۔Recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 اور alpha-7.3 giardines (ہر ​​ایک لین کے اوپر) کو پرائمری ماؤس peritoneal macrophages میں تبدیل کر دیا گیا اور کلچر سپرنٹنٹس کو 24 گھنٹے بعد کاٹا گیا۔ویسٹرن بلوٹنگ کا استعمال سگنیچر کیسپیس -1 p20 سوزش پروٹین کے اظہار کی سطح کی پیمائش کے لئے کیا گیا تھا۔PBS-صرف علاج گروپ (لین C) اور pcDNA3.1 (+) monotherapy گروپ (pcDNA3.1 لین) کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور GEV ٹریٹمنٹ گروپ کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ریکومبیننٹ پروٹین کے اظہار کی تصدیق ہر پروٹین میں ہسٹائڈائن ٹیگ کا پتہ لگا کر کی گئی تھی، اور متوقع پروٹین بینڈ الفا-2 جیارڈائن (38.2 کے ڈی اے) اور الفا-7.3 جیارڈائن (37.2 کے ڈی اے) تھے۔GEV، Giardia duodenum extracellular vesicles، pcDNA3.1(+), EcoRV- linearized vector, SUP, supernatant
اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا alpha-2 giardine اور alpha-7.3 giardine p20 caspase-1 اظہار کی حوصلہ افزائی کرتے ہیں اور میزبان NLRP3 سوزشی ردعمل کو فعال کرنے میں کردار ادا کرتے ہیں، pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine اور pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 جیارڈین کو ریکومبیننٹ پلاسمڈ ڈی این اے کے ساتھ پرائمری ماؤس پیریٹونیل میکروفیجز میں تبدیل کیا گیا تھا، اور کلیدی سوزش والے پروٹین NLRP3 کے اظہار، لوکلائزیشن اور اولیگومرائزیشن کی سطحوں کا تعین کیا گیا تھا۔اس تجربے میں، GEV کو مثبت کنٹرول گروپ کے طور پر استعمال کیا گیا، اور کوئی ٹریٹمنٹ گروپ (صرف PBS) یا pcDNA3.1(+) ٹرانسفیکشن ٹریٹمنٹ گروپ منفی گروپ تھا۔نتائج سے ظاہر ہوا کہ جیسا کہ GEV گروپ میں ہے، giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 اور giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 کے ریکومبیننٹ پلاسمڈ DNA کے نتیجے میں NLRP3، pro-IL-1β اور procaspase-1 اور caspase-1 ایکٹیویشن (تصویر 2a)۔اس کے علاوہ، دونوں giardines نے اہم IL-1β سراو (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.007 )۔;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (شکل 2b)۔زیادہ تر ASC پروٹین بغیر علاج والے گروپ میں یا علاج کے گروپ میں pcDNA3.1(+) پلازمیڈ کے ساتھ منتقلی میں monomeric تھے، اس کے برعکس pcDNA3.1(+)-alpha-2 یا pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 جیارڈائن۔ASC oligomerization GEV مثبت کنٹرول گروپ یا گروپ کے ریکومبیننٹ پلاسمڈ DNA میں ہوا، جس میں ایک oligomeric شکل (شکل 2c) دکھائی دیتی ہے۔یہ ابتدائی اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ الفا-2 جیارڈائن اور الفا-7،3 جارڈائن NLRP3 سوزش کو چالو کر سکتے ہیں۔ASC اور NLRP3 کے لوکلائزیشن کے بعد کے امیونو فلوروسینٹ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ منفی کنٹرول گروپ میں، ASC پروٹین پورے سائٹوپلازم میں بکھرا ہوا تھا اور pcDNA3.1(+)-alpha-2 کے giardine یا pcDNA3 کے ساتھ محرک ہونے پر ایک ڈاٹ سگنل کے طور پر ظاہر ہوا تھا۔1(+)-alpha-7,3 giardine گروپ یا GEV مثبت کنٹرول گروپ (شکل 2d)۔منفی کنٹرول اور پلازمیڈ سے علاج شدہ pcDNA 3.1 گروپوں میں، NLRP3 پروٹین سگنل کا پتہ نہیں چلا، جبکہ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine یا pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 کے جواب میں فلوروسینٹ سگنل ڈاٹ۔ پتہ چلا تھا..giardine cytoplasm میں یا HEV کے محرک پر پائے جاتے ہیں (تصویر 2e)۔یہ اعداد و شمار مزید ظاہر کرتے ہیں کہ G. duodenalis giardin alpha-2 اور giardin alpha-7.3 ماؤس پرائمری پیریٹونیل میکروفیجز میں NLRP3 سوزش کو چالو کرتے ہیں۔
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin اور pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ماؤس peritoneal macrophages میں NLRP3 سوزش کو چالو کرتے ہیں۔ریکومبیننٹ یوکرائیوٹک ایکسپریشن پلازمیڈز pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin اور pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin کو پرائمری مورین پیریٹونیئل میکروفیجز اور سیلز میں منتقل کریں، یا ایکسپریشن کے تجزیہ کے لیے 24 گھنٹے کے اندر سپرنٹنٹ کی کٹائی کریں، اولیگومرائزیشن , رطوبت.اور کلیدی اشتعال انگیز پروٹین کی لوکلائزیشن۔صرف PBS (C) گروپ اور pcDNA3.1 (+) سنگل ٹریٹمنٹ گروپ کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور GEV ٹریٹمنٹ گروپ کو مثبت گروپ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔ایک کلیدی سوزش والی پروٹین NLRP3، بشمول NLRP3، pro-IL-1β، pro-caspase-1، اور p20 caspase-1، مغربی بلوٹنگ کے ذریعے پتہ چلا۔b سپرنٹنٹس میں IL-1β کے سراو کی سطح کا تعین انزائم سے منسلک امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔کنٹرول اور تجرباتی گروپوں کے درمیان فرق کا تجزیہ SPSS سافٹ ویئر ورژن 22.0 کا استعمال کرتے ہوئے تغیر (ANOVA) کے یک طرفہ تجزیہ سے کیا گیا۔ستارے **P <0.01 اور ***P <0.001 گروپوں کے درمیان اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔c چھروں میں ASC oligomerization کی سطح DSS کراس لنکنگ تجزیہ کے ذریعہ طے کی گئی تھی ، جبکہ سیل lysates میں ASC کی سطح کو لوڈنگ کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔d امیونو فلوروسینس کا استعمال کرتے ہوئے ISC لوکلائزیشن کا تصور۔ای امیونو فلوروسینس کا استعمال NLRP3 کے لوکلائزیشن کو دیکھنے کے لیے کیا گیا تھا۔ASC، اپوپٹوٹک سپیک نما پروٹین؛IL، interleukin؛NLRP3، نیوکلیوٹائڈ بائنڈنگ اولیگومرائزیشن نما رسیپٹر 3؛ns، اہم نہیں (P > 0.05)
G. duodenalis اور GEVs دونوں جو اس کو چھپاتے ہیں NLRP3 سوزش کو چالو کرتے ہیں اور وٹرو میں میزبان سوزش کے ردعمل کو منظم کرتے ہیں۔اس طرح، G. duodenalis کی روگجنکیت میں NLRP3 سوزش کا کردار ابھی تک واضح نہیں ہے۔اس مسئلے کی تحقیقات کے لیے، ہم نے G. duodenalis cyst سے متاثرہ چوہوں اور G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor کے علاج سے متاثرہ چوہوں کے درمیان ایک تجربہ ڈیزائن کیا اور G. duodenalis cyst سے متاثر ہونے پر NLRP3 سوزش کے اظہار کا موازنہ کیا۔تجربے کی تفصیلی اسکیم تصویر 3a میں دکھائی گئی ہے۔مختلف ٹریٹمنٹ گروپس میں چوہوں کے جسمانی وزن میں ہونے والی تبدیلیوں کو سسٹس کے انفیکشن کے بعد 7 دن تک مانیٹر کیا گیا اور نتائج تصویر 3b میں دکھائے گئے ہیں۔خالص PBS کے ساتھ علاج کیے گئے گروپ کے مقابلے میں، نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ (i) G. duodenalis cyst سے متاثرہ چوہوں کے جسمانی وزن میں انفیکشن کے بعد 3 دن سے 7 دن تک کمی آئی ہے۔(ii) MCC950 inhibitor کے ساتھ علاج کا چوہوں کے جسمانی وزن پر کوئی خاص اثر نہیں ہوا۔.واحد انفیکشن گروپ کے مقابلے میں، MCC950 کے ساتھ علاج کیے گئے گرہنی کے انفیکشن گروپ کا BW مختلف ڈگریوں تک کم ہو گیا (دن 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148؛ دن 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0.4602، P <0.0001؛ دن 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; دن 4: ANOVA, F(3, 24) = 1.683, P = 0.0052, ANO (3, 24)=0.6497, P=0.0645; دن 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175; ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202)۔یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ NLRP3 سوزش چوہوں کو گرہنی کے انفیکشن کے ابتدائی مراحل (2-4 دن) میں وزن میں نمایاں کمی سے بچاتا ہے۔اس کے بعد ہمارا مقصد گرہنی کے لیویج سیال میں G. duodenalis trophozoites کا پتہ لگانا تھا اور نتائج کو شکل 3c میں دکھایا گیا ہے۔G. duodenalis cyst انفیکشن گروپ کے مقابلے، NLRP3 inflammasome (t(12) = 2.902، P = 0.0133) کو مسدود کرنے کے بعد گرہنی میں ٹرافوزائیٹس کی تعداد میں نمایاں اضافہ ہوا۔صرف PBS اور MCC950 کے ساتھ علاج کیے گئے منفی کنٹرول کے مقابلے میں HE کے ساتھ داغے ہوئے گرہنی کے ٹشوز نے دکھایا: (i) G. duodenalis cyst انفیکشن کے نتیجے میں duodenal villi (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P= 0.0488 کو نقصان پہنچا۔ ) اور کرپٹ ایٹروفی (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089)؛(ii) G. duodenalis cysts سے متاثر چوہوں سے گرہنی اور MCC950 inhibitors کے ساتھ علاج کیا گیا۔گرہنی والی ویلی کو نقصان پہنچا اور مردہ (ANOVA, F(3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) atrophy اور crypt برانچنگ کے ساتھ (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (تصویر 3d- f)یہ نتائج بتاتے ہیں کہ NLRP3 سوزش G. duodenalis کے روگجنک کو کم کرنے میں کردار ادا کرتا ہے۔
Giardia duodenum کے انفیکشن میں NLRP3 سوزش کا کردار۔چوہوں کو ڈوڈینوکوکل سسٹس کے ساتھ گیویج کیا گیا تھا اور پھر MCC950 (ip) کے ساتھ یا اس کے بغیر علاج کیا گیا تھا۔PBS یا MCC950 کے ساتھ سنگل ٹریٹمنٹ گروپس کو بطور کنٹرول استعمال کیا گیا تھا۔تجرباتی گروپ اور علاج کا طریقہ۔b مختلف علاج گروپوں میں سے ہر ایک میں چوہوں کے جسمانی وزن کی 7 دن تک نگرانی کی گئی۔G. duodenalis انفیکشن گروپ اور G. duodenalis + MCC950 انفیکشن ٹریٹمنٹ گروپ کے درمیان فرق کا تجزیہ SPSS سافٹ ویئر ورژن 22.0 کا استعمال کرتے ہوئے t-ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا۔ستارے *P <0.05، **P <0.01، یا ***P <0.001 پر نمایاں فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔c پرجیوی بوجھ کا تعین گرہنی کے لیویج سیال میں ٹرافوزائٹس کی تعداد گن کر کیا گیا تھا۔G. duodenalis انفیکشن گروپ اور G. duodenalis + MCC950 انفیکشن ٹریٹمنٹ گروپ کے درمیان فرق کا تجزیہ SPSS سافٹ ویئر ورژن 22.0 کا استعمال کرتے ہوئے t-ٹیسٹ کے ذریعے کیا گیا۔ستارے *P <0.05 پر اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔d ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) گرہنی کے ہسٹوپیتھولوجی کے داغدار نتائج۔سرخ تیر ولی کو پہنچنے والے نقصان کی نشاندہی کرتے ہیں، سبز تیر کرپٹس کو پہنچنے والے نقصان کی نشاندہی کرتے ہیں۔اسکیل بار: 100 µm۔e، f گرہنی کی اونچائی اور ماؤس کریپٹ کی اونچائی کا شماریاتی تجزیہ۔ستارے *P <0.05 اور **P <0.01 پر نمایاں فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔نتائج 7 آزاد حیاتیاتی تجربات سے لیے گئے ہیں۔BW، جسمانی وزن؛ig، intragastric ترسیل کا راستہ؛ip, intraperitoneal ترسیل کا راستہ؛ns، اہم نہیں (P > 0.05)؛پی بی ایس، فاسفیٹ بفرڈ نمکین؛ڈبلیو ٹی، جنگلی قسم
IL-1β کا سراو سوزش کو چالو کرنے کی ایک پہچان ہے۔اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا G. duodenalis alpha-2 giardine اور alpha-7.3 giardine Vivo میں NLRP3 میزبان سوزش کو چالو کرتے ہیں، ہم نے علاج نہ کیے ہوئے WT چوہوں (شیم گروپ) اور NLRP3 انفلاماسم بلاک شدہ چوہوں (MCC950 inhibited treatment group) کا استعمال کیا۔تجربے کی تفصیلی اسکیم تصویر 4a میں دکھائی گئی ہے۔تجرباتی گروپوں میں چوہوں پر مشتمل ہوتا ہے جن کا علاج PBS، G. duodenalis cyst treatment by gavage، intramuscular inject of pcDNA3.1، اور pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine یا pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine کے intramuscular انجکشن سے کیا جاتا ہے۔ریکومبیننٹ پلاسمڈ کی انٹرماسکلر انتظامیہ کے بعد 7 ویں دن، سیرم جمع کیا گیا اور ہر گروپ میں IL-1β کی سطح کا تعین کیا گیا۔جیسا کہ شکل 4b میں دکھایا گیا ہے، MOCK گروپ میں: (i) PBS گروپ کے مقابلے میں، pcDNA3.1 علاج کا IL-1β سراو (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998) پر کوئی خاص اثر نہیں پڑا، تاہم، G. duodenalis cyst group (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002)، (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine اور pcDNA3 میں IL-β سراو نمایاں طور پر بلند ہوا۔1- الفا-7.3 جیارڈائن کے انٹرماسکلر انجیکشن نے سیرم IL-1β کی سطح میں نمایاں اضافہ کیا (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine نے pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular انجیکشن گروپ (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) میں IL-1β سراو کی اعلی سطح کی حوصلہ افزائی کی۔ .MCC950 ٹریٹمنٹ گروپ اور MOCK گروپ میں ہر گروپ کے مقابلے میں: (i) PBS کنٹرول گروپ اور pcDNA3.1 کنٹرول گروپ میں IL-1β سراو کی سطح MCC950 inhibitor کو بلاک کرنے کے بعد ایک خاص حد تک کم ہو گئی، لیکن فرق نہیں تھا۔ اہم (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949)؛(ii) MCC950 کو بلاک کرنے کے بعد۔G. duodenalis cyst-infected group, pcDNA3.1-alpha-2 giardine گروپ، اور pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine گروپ (G. duodenalis: ANOVA, F(9) میں IL-1β سراو نمایاں طور پر کم ہو گیا تھا۔ , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, ) = 3.540، P = 0.0164)۔ان نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ الفا-2 جیارڈائن اور الفا-7.3 جیارڈائن Vivo میں NLRP3 سوزش کو چالو کرنے میں ثالثی کرتے ہیں۔
pcDNA3.1(+)-giardines Vivo میں NLRP3 میزبان سوزش کو چالو کرتے ہیں۔چوہوں کو ریکومبیننٹ یوکرائیوٹک ایکسپریشن پلازمیڈ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine یا pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine کے ساتھ حفاظتی ٹیکے لگائے گئے اور پھر MCC950 (ip; MCC950 گروپ) کے ساتھ علاج کیا گیا یا نہیں (ڈمی گروپ) )۔PBS یا pcDNA3.1(+) پلازمیڈ ٹریٹمنٹ گروپ کو منفی کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا، G. duodenalis cyst علاج گروپ کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کیا گیا۔تجرباتی گروپ اور علاج کا طریقہ۔b چوہوں میں IL-1β کے سیرم کی سطح 7 ویں دن ELISA پرکھ کے ذریعہ ماپا گیا۔MOCK گروپ میں گروپوں کے درمیان اختلافات کا یک طرفہ ANOVA کا استعمال کرتے ہوئے تجزیہ کیا گیا، اور SPSS سافٹ ویئر ورژن 22.0 کے t-ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے MOCK گروپ اور MCC950 گروپ کے درمیان اختلافات کا تجزیہ کیا گیا۔نجمہ MOCK گروپ، *P<0.05 اور ***P<0.001;ڈالر کے نشان ($) MOCK گروپ میں ہر گروپ اور P <0.05 پر MCC950 گروپ کے درمیان اہم فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔سات آزاد حیاتیاتی تجربات کے نتائج۔i، intramuscular انجکشن، ns، اہم نہیں (P > 0.05)
G. duodenalis infectivity پر NLRP3 میزبان سوزش کی الفا-2 اور الفا-7.3 جائرڈائن ثالثی ایکٹیویشن کے اثر کی چھان بین کرنے کے لیے، ہم نے WT C57BL/6 چوہوں کا استعمال کیا اور الفا-2 giardine اور alpha-7.3 giardine کا انجکشن لگایا۔G. duodenalis cyst کی گیسٹرک ٹیوب کے ذریعے 3 دن کے بعد پلازمڈ کو انٹرا مسکلر طریقے سے انجکشن لگایا گیا، جس کے بعد چوہوں کو 7 دن تک دیکھا گیا۔تجربے کی تفصیلی اسکیم تصویر 5a میں دکھائی گئی ہے۔ہر ماؤس کے جسمانی وزن کو ہر روز ماپا جاتا تھا، گیسٹرک ٹیوب کے ذریعے انتظامیہ کے بعد 7 ویں دن تازہ گرہنی کے ٹشو کے نمونے جمع کیے گئے تھے، ٹروفوزائٹس کی تعداد کی پیمائش کی گئی تھی، اور ہسٹوپیتھولوجیکل تبدیلیاں دیکھی گئی تھیں۔جیسا کہ شکل 5b میں دکھایا گیا ہے، کھانا کھلانے کے وقت میں اضافہ کے ساتھ، ہر گروپ میں چوہوں کا BW آہستہ آہستہ بڑھتا گیا۔چوہوں کی MT G. duodenalis cysts کے انٹراگاسٹرک انتظامیہ کے بعد تیسرے دن کم ہونا شروع ہوئی، اور پھر آہستہ آہستہ بڑھتی گئی۔الفا-2 جیارڈائن اور الفا 7.3 جیارڈائن کے انٹرا مسکولر انجیکشن کے ذریعہ این ایل آر پی 3 انفلاماسوم کو چالو کرنے سے چوہوں میں وزن میں نمایاں کمی واقع ہوئی (دن 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 1.39 = 0.9754 دن 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 دن 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F( 4, 30) = 0.3172، P = 0.9979؛ دن 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; دن 3: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, A 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 دن 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083 دن 4: pcDNA3.1-alpha-2, , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, دن 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, دن 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 دن 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 دن 6: pcDNA alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, دن 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;دن 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 دن 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001)۔پرجیوی بوجھ کا اندازہ گرہنی (تصویر 5 سی) میں کیا گیا تھا۔غیر علاج شدہ مثبت کنٹرول اور خالی pcDNA3.1 ویکٹر کے ساتھ انجکشن لگائے گئے گروپ کے مقابلے، α-2 giardine اور α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha) کے ساتھ انجکشن لگائے گئے گروپوں میں G. duodenalis trophozoites کی تعداد نمایاں طور پر کم ہو گئی تھی۔ -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001)۔اس کے علاوہ، giardine alfa-7.3 چوہوں میں giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081) سے زیادہ حفاظتی تھا۔ایچ ای سٹیننگ کے نتائج انجیر میں دکھائے گئے ہیں۔5d–fالفا-2 جیارڈائن اور الفا-7.3 جیارڈائن کے ساتھ لگائے گئے چوہوں میں گرہنی کے ٹشووں کے کم زخم تھے، جو کہ جی ڈیوڈینالیس کے ساتھ لگائے گئے چوہوں اور جی ڈیوڈینالیس کے ساتھ لگائے گئے چوہوں کے مقابلے میں ایک خالی pcDNA3 ویکٹر .1 Zoom کے ساتھ مل کر ظاہر ہوتے ہیں۔(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 or P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, = 0.0028 یا P = 0.0055) اور کم کرپٹ ایٹروفی (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 یا P = 0.0158؛ pcDNA3.1-alpha-2 giardine: , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 یا P = 0.0191)۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ الفا-2 جیارڈائن اور الفا-7,3 جیارڈائن Vivo میں NLRP3 سوزش کو فعال کرکے G. duodenalis کی انفیکشن کو کم کرتے ہیں۔
G. duodenalis انفیکشن میں pcDNA3.1(+)-giardins کا کردار۔چوہوں کو ریکومبیننٹ یوکرائیوٹک ایکسپریشن پلازمیڈ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine یا pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine کے ساتھ حفاظتی ٹیکے لگائے گئے اور پھر G. duodenalis cysts (ig) کے ساتھ چیلنج کیا گیا۔پی بی ایس گروپ اور پی سی ڈی این اے 3.1 (+) + ڈوڈینل سسٹ ٹریٹمنٹ گروپ کو منفی کنٹرول گروپ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا، اور ڈوڈینل سسٹ ٹریٹمنٹ گروپ کو مثبت کنٹرول گروپ کے طور پر استعمال کیا گیا تھا۔تجرباتی گروپ اور علاج کا طریقہ۔b مختلف علاج گروپوں میں سے ہر ایک میں چوہوں کی MT کو چیلنج کے بعد 7 دن تک مانیٹر کیا گیا۔ستارے G. duodenalis گروپ اور pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine گروپ، *P <0.05، **P <0.01، اور ***P <0.001;ڈالر کا نشان ($) G. duodenalis کے ہر گروپ اور pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جارڈائن گروپ، $$P<0.01 اور $$$P<0.001 کے درمیان ایک اہم فرق کی نشاندہی کرتا ہے۔c پرجیوی بوجھ کا تعین گرہنی (3 سینٹی میٹر لمبا) سے 1 ملی لیٹر گرہنی کے لیویج میں ٹرافوزائیٹس کی تعداد کو گن کر کیا گیا تھا اور گرہنی کے فی سینٹی میٹر پرجیویوں کی تعداد کے طور پر ظاہر کیا گیا تھا۔G. duodenalis انفیکشن گروپ، pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine گروپ، اور pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine گروپ کے درمیان فرق کا تجزیہ SPSS سافٹ ویئر ورژن 22.0 کا استعمال کرتے ہوئے یک طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا۔ستارے **P <0.01 اور ***P <0.001 پر نمایاں فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔d گرہنی میں ہسٹوپیتھولوجیکل تبدیلیاں۔سرخ تیر ولی کو پہنچنے والے نقصان کی نشاندہی کرتے ہیں، سبز تیر کرپٹس کو پہنچنے والے نقصان کی نشاندہی کرتے ہیں۔اسکیل بار: 100 µm۔e، f ماؤس گرہنی کی اونچائی (e) اور crypt height (f) کا شماریاتی تجزیہ۔شکل 1d میں گروپوں کے درمیان اختلافات کا تجزیہ SPSS سافٹ ویئر ورژن 22.0 کا استعمال کرتے ہوئے یک طرفہ ANOVA کے ذریعے کیا گیا۔ستارے *P <0.05 اور **P <0.01 پر نمایاں فرق کی نشاندہی کرتے ہیں۔سات آزاد حیاتیاتی تجربات کے نتائج۔ns، اہم نہیں (P > 0.05)
Giardia duodenum انسانوں اور دوسرے ستنداریوں کا ایک معروف آنتوں کا پرجیوی ہے جو giardiasis کا سبب بنتا ہے۔2004 میں، اسے 6 سال کے دوران زیادہ پھیلنے کی وجہ سے، خاص طور پر پست سماجی اقتصادی حیثیت رکھنے والی کمیونٹیز میں [32] کی وجہ سے ڈبلیو ایچ او کے نظرانداز کردہ امراض کے اقدام میں شامل کیا گیا تھا۔پیدائشی مدافعتی نظام G. duodenalis انفیکشن کے مدافعتی ردعمل میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ماؤس میکروفیجز کے بارے میں بتایا گیا ہے کہ وہ ایکسٹرا سیلولر ٹریپس کو چھوڑ کر G. duodenalis کو گھیر لیتے ہیں اور مار دیتے ہیں [33]۔ہمارے پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ G. duodenalis، ایک غیر حملہ آور ایکسٹرا سیلولر پرجیوی، p38 MAPK، ERK، NF-κB p65، اور NLRP3 سوزش کے سگنلنگ راستے کو ماؤس میکروفیجز میں فعال کرتا ہے تاکہ میزبان اشتعال انگیز ردعمل کو منظم کیا جا سکے، اور جاری کردہ GEV اس عمل کو بڑھا سکتا ہے۔13]، 24]۔تاہم، جی ای وی میں این ایل آر پی 3 انفلاماسوم ریگولیٹڈ سوزش میں شامل عین PAMPs اور جیارڈیاسس میں این ایل آر پی 3 سوزش کے کردار کو واضح کرنا باقی ہے۔ان دو سوالات پر روشنی ڈالنے کے لیے، ہم نے یہ مطالعہ کیا۔
NLRP3 سوزش مدافعتی خلیوں کے سائٹوپلازم میں واقع ہے اور اسے مختلف ذرات جیسے یورک ایسڈ کرسٹل، ٹاکسن، بیکٹیریا، وائرس اور پرجیویوں کے ذریعے فعال کیا جا سکتا ہے۔بیکٹیریل اسٹڈیز میں، ٹاکسن کو کلیدی PAMPs کے طور پر شناخت کیا گیا ہے جو سوزش کے سینسر کو چالو کرتے ہیں، جس سے سوزش اور سیل کی موت ہوتی ہے [34]۔کچھ ساختی طور پر متنوع ٹاکسنز، جیسے کہ سٹیفیلوکوکس اوریئس [35] اور ایسچریچیا کولی [36] سے ہیمولسین، انٹروٹوکسین (NHE) [37] سے ہیمولیسن BL (HBL)، NLRP3 کی سوزش کو متحرک کرتے ہیں۔وائرل مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ وائرلیس پروٹین جیسے SARS-COV-2 لفافہ (E) پروٹین [38] اور Zika وائرس NS5 پروٹین [39] NLRP3 ریسیپٹر کے ذریعہ پہچانے گئے اہم PAMPs ہیں۔پرجیوی مطالعات میں، بہت سے پرجیویوں کے میزبان سوزش کے عمل کے ساتھ منسلک ہونے کی اطلاع دی گئی ہے، جیسے ٹوکسوپلاسما گونڈی، ٹرائیکوموناس ویجینالیس [40]، ٹریپینوسوما کروزی [41]، اور لیشمانیا [42]۔گھنے دانے دار پروٹین GRA35، GRA42، اور GRA43، جو Toxoplasma gondii کے وائرس سے وابستہ ہیں، لیوس چوہا میکروفیجز [43] میں پائروپٹوسس شامل کرنے کے لیے ضروری ہیں۔اس کے علاوہ، لشمانیا کے کچھ مطالعات نے NLRP3 سوزش میں شامل انفرادی مالیکیولز پر توجہ مرکوز کی ہے، جیسے پرجیوی جھلی لیپو فاسفوگلائکن [44] یا زنک میٹالوپروٹیز [45]۔اینیکسن نما الفا جیارڈین جینز کے خاندان میں، الفا-1 گیارڈین کو ایک ممکنہ ویکسین امیدوار کے طور پر دکھایا گیا ہے جو ماؤس ماڈل میں G. duodenalis کے خلاف تحفظ فراہم کرتا ہے [18]۔ہمارے مطالعے میں، ہم نے G. duodenalis وائرلینس عوامل الفا-2 اور الفا-7,3 giardines کا انتخاب کیا، جو giardia کے لیے منفرد ہیں لیکن نسبتاً کم رپورٹ ہوئے ہیں۔ان دو ٹارگٹ جینوں کو pcDNA3.1(+) یوکرائیوٹک ایکسپریشن سسٹم ویکٹر میں سوزش کی ایکٹیویشن کے تجزیہ کے لیے کلون کیا گیا تھا۔
ہمارے ماؤس ماڈل میں، کلیویڈ کیسپیس کے ٹکڑے اشتعال انگیز ایکٹیویشن کے مارکر کے طور پر کام کرتے ہیں۔محرک ہونے پر، NLRP3 ASC کے ساتھ تعامل کرتا ہے، پروکاسپیسز کو بھرتی کرتا ہے، اور فعال کیسپیسز بناتا ہے جو pro-IL-1β اور pro-IL-18 کو بالترتیب بالغ IL-1β اور IL-18 میں -18 میں تقسیم کرتا ہے۔سوزشی کیسپیسز (کیسپیسز -1، -4، -5 اور -11) سیسٹین پروٹیز کا ایک محفوظ خاندان ہے جو فطری دفاع کے لیے اہم ہیں اور سوزش اور پروگرام شدہ سیل کی موت میں ملوث ہیں [46]۔Caspase-1 کینونیکل inflammasomes [47] کے ذریعے چالو کیا جاتا ہے، جبکہ کیسپیس-4، -5، اور -11 atypical inflammasomes [48] کی تشکیل کے دوران کلیویڈ ہوتے ہیں۔اس مطالعہ میں، ہم نے ماؤس پیریٹونیل میکروفیجز کو بطور ماڈل استعمال کیا اور G. duodenalis انفیکشن کے مطالعہ میں میزبان NLRP3 سوزش ایکٹیویشن کے مارکر کے طور پر p20 caspase-1 cleaved caspase-1 کی تحقیقات کی۔نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ بہت سے الفا گارڈینز سوزش کی عام ایکٹیویشن کے لیے ذمہ دار ہیں، جو بیکٹیریا اور وائرس میں شامل کلیدی وائرلیس مالیکیولز کی دریافت کے مطابق ہے۔تاہم، ہمارا مطالعہ صرف ایک ابتدائی اسکرین ہے اور اس میں دیگر مالیکیولز بھی ہیں جو غیر کلاسیکی سوزشوں کو متحرک کرسکتے ہیں، جیسا کہ ہمارے پچھلے مطالعے میں جی ڈیوڈینالیس انفیکشن [13] میں کلاسیکی اور غیر کلاسیکی دونوں قسم کی سوزشیں پائی گئیں۔مزید اس بات کا تعین کرنے کے لیے کہ آیا تیار کردہ p20 کیسپیس-1 NLRP3 سوزش کے ساتھ منسلک ہے، ہم نے کلیدی مالیکیول پروٹین ایکسپریشن لیول اور ASC oligomerization کی سطحوں کا تعین کرنے کے لیے الفا-2 اور الفا-7.3 giardins کو ماؤس پیریٹونیئل میکروفیجز میں منتقل کیا، اس بات کی تصدیق کرتے ہوئے کہ دونوں α-giardins ایکٹیویٹ ہوتے ہیں۔ سوزش والی NLRP3۔ہمارے نتائج Manko-Prykhoda et al. کے نتائج سے قدرے مختلف ہیں، جنہوں نے رپورٹ کیا کہ G. muris یا E. coli EPEC strains کے ساتھ Caco-2 خلیات کا محرک NLRP3، ASC، اور caspase-1 کی فلوروسینس کی شدت کو بڑھا سکتا ہے، اگرچہ نمایاں طور پر نہیں، جب کہ G. muris اور E. coli کی لاگت نے تین پروٹینوں کی سطح کو کیسے بڑھایا [49]۔یہ فرق Giardia پرجاتیوں، سیل لائنوں اور بنیادی خلیوں کے انتخاب میں فرق کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ہم نے ایم سی سی 950 کا استعمال کرتے ہوئے 5 ہفتے کی عمر کی خواتین WT C57BL/6 چوہوں میں Vivo Assess میں بھی کارکردگی کا مظاہرہ کیا، جو G. duodenalis کے لیے زیادہ حساس ہیں۔MCC950 ایک طاقتور اور منتخب چھوٹے مالیکیول NLRP3 روکنے والا ہے جو نانومولر ارتکاز پر کینونیکل اور غیر کینونیکل NLRP3 ایکٹیویشن کو روکتا ہے۔MCC950 NLRP3 ایکٹیویشن کو روکتا ہے لیکن AIM2، NLRC4، اور NLRP1 سوزش کے راستوں یا TLR سگنلنگ پاتھ ویز کی ایکٹیویشن کو متاثر نہیں کرتا ہے [27]۔MCC950 NLRP3 ایکٹیویشن کو روکتا ہے لیکن NLRP3 شروع کرنے، K+ efflux، Ca2+ آمد، یا NLRP3 اور ASC کے درمیان تعامل کو نہیں روکتا؛اس کے بجائے، یہ ASC oligomerization [27] کو مسدود کرکے NLRP3 کی سوزش کی ایکٹیویشن کو روکتا ہے۔لہذا، ہم نے giardine انجیکشن کے بعد NLRP3 سوزش کے کردار کا تعین کرنے کے لئے ایک ان ویوو مطالعہ میں MCC950 کا استعمال کیا۔چالو کیسپیس -1 p10 پرو سوزش والی سائٹوکائنز پرو IL-1β اور پرو IL-18 کو بالغ IL-1β اور IL-18 [50] میں توڑ دیتا ہے۔اس مطالعے میں، MCC950 کے ساتھ یا اس کے بغیر giardine سے علاج شدہ چوہوں میں سیرم IL-1β کی سطح کو اس بات کے اشارے کے طور پر استعمال کیا گیا کہ آیا NLRP3 سوزش کو چالو کیا گیا تھا۔جیسا کہ توقع کی گئی ہے، MCC950 علاج نے سیرم IL-1β کی سطح کو نمایاں طور پر کم کیا۔یہ اعداد و شمار واضح طور پر ظاہر کرتے ہیں کہ G. duodenalis giardin alfa-2 اور giardin alfa-7.3 NLRP3 ماؤس سوزش کو چالو کرنے کے قابل ہیں۔
پچھلی دہائی کے دوران جمع کیے گئے اہم اعداد و شمار نے یہ ثابت کیا ہے کہ IL-17A G. muris کے خلاف قوت مدافعت کا ماسٹر ریگولیٹر ہے، IL-17RA سگنلنگ، antimicrobial peptides پیدا کرتا ہے، اور تکمیلی ایکٹیویشن کو منظم کرتا ہے [51]۔تاہم، Giardia انفیکشن نوجوان بالغوں میں زیادہ کثرت سے پایا جاتا ہے، اور یہ اطلاع دی گئی ہے کہ نوجوان چوہوں میں Giardia انفیکشن IL-17A کے ردعمل کو اپنے حفاظتی اثر [52] کو فعال نہیں کرتا ہے، جس سے محققین کو دوسرے امیونو موڈولیٹری Giardia کی تلاش کرنے پر اکسایا جاتا ہے۔ہیلمینتھ انفیکشن کے میکانزم.ایک حالیہ تحقیق کے مصنفین نے بتایا کہ G. muris E. coli EPEC کے ذریعے NLRP3 سوزش کو چالو کر سکتا ہے، جو antimicrobial peptides کی پیداوار کو فروغ دیتا ہے اور اس کے منسلک ہونے کی صلاحیت اور آنتوں کی نالی میں trophozoites کی تعداد کو کم کرتا ہے، اس طرح بڑی آنت کی شدت کو کم کرتا ہے۔ بیسیلی کی وجہ سے ہونے والی بیماریاں [49]۔NLRP3 سوزش مختلف بیماریوں کی نشوونما میں ملوث ہے۔مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ سیوڈموناس ایروگینوسا خلیوں کی موت سے بچنے کے لیے میکروفیجز میں آٹوفیجی کو متحرک کرتا ہے، اور یہ عمل NLRP3 سوزش کے فعال ہونے پر منحصر ہے [53]۔N. caninum کے لیے، NLRP3 سوزش کی رد عمل آکسیجن پرجاتیوں کی ثالثی ایکٹیویشن میزبان میں اس کی نقل کو محدود کرتی ہے، جس سے یہ ایک ممکنہ علاج کا ہدف بنتا ہے [9]۔Paracoccidioides brasiliensis کو ماؤس بون میرو سے ماخوذ ڈینڈریٹک خلیوں میں NLRP3 سوزش کو متحرک کرنے کے لیے پایا گیا ہے، جس کے نتیجے میں سوزش والی سائٹوکائن IL-1β کی رہائی ہوتی ہے، جو میزبان دفاع میں اہم کردار ادا کرتی ہے [10]۔لیشمینیا کی کئی اقسام، جن میں L. amazonensis، L. major، L. braziliensis، اور L. infantum chagasi شامل ہیں، NLRP3 اور ASC پر منحصر caspase-1 کو میکروفیجز میں فعال کرتے ہیں، نیز لیشمینیا انفیکشن۔NLRP3/ASC/caspase-1 جین [11] میں چوہوں کی کمی میں پرجیوی نقل کو بڑھایا جاتا ہے۔زمبونی وغیرہ۔لیشمینیا انفیکشن کے بارے میں بتایا گیا ہے کہ وہ میکروفیجز میں NLRP3 سوزش کو متحرک کرتا ہے، جو انٹرا سیلولر پرجیوی نقل کو محدود کرتا ہے۔اس طرح، لشمانیا سے بچنے کی حکمت عملی کے طور پر NLRP3 ایکٹیویشن کو روک سکتا ہے۔Vivo مطالعات میں، NLRP3 سوزش نے لشمانیا کے خاتمے میں حصہ لیا، لیکن ٹشوز کو متاثر نہیں کیا [54]۔اس کے برعکس، ہیلمینتھیاسس کے مطالعے میں، NLRP3 سوزش کے فعال ہونے سے معدے کی ہیلمینتھیاسس کے خلاف میزبان کی حفاظتی قوت مدافعت کو دبا دیا جاتا ہے [12]۔شیگیلا دنیا بھر میں اسہال کا باعث بننے والے اہم بیکٹیریا میں سے ایک ہے۔یہ بیکٹیریا IL-1β کی پیداوار کو P2X7 ریسیپٹر میڈیٹڈ K+ بہاؤ، ری ایکٹو آکسیجن اسپیسز، لائسوسومل تیزابیت، اور مائٹوکونڈریل نقصان کے ذریعے پیدا کر سکتے ہیں۔NLRP3 سوزش شگیلا [55] کے خلاف میکروفیجز کی فگوسیٹوسس اور جراثیم کش سرگرمی کو منفی طور پر منظم کرتا ہے۔پلازموڈیم کے مطالعے سے معلوم ہوا ہے کہ AIM2، NLRP3 یا کیسپیس-1 کی کمی والے چوہے پلاسموڈیم سے متاثر ہوتے ہیں جو کہ ٹائپ 1 انٹرفیرون کی اعلیٰ سطح پیدا کرتے ہیں اور پلازموڈیم انفیکشن کے خلاف زیادہ مزاحم ہوتے ہیں [56]۔تاہم، چوہوں میں NLRP3 سوزش کے روگجنک ایکٹیویشن کو دلانے میں الفا-2 جیارڈائن اور الفا-7.3 جارڈائن کا کردار واضح نہیں ہے۔
اس مطالعہ میں، MCC950 کے ذریعہ NLRP3 سوزش کی روک تھام نے BW کو کم کیا اور چوہوں میں آنتوں کے لیویج سیال میں ٹرافوزائٹس کی تعداد میں اضافہ کیا، جس کے نتیجے میں گرہنی کے بافتوں میں زیادہ شدید پیتھولوجیکل تبدیلیاں آئیں۔Alpha-2 giardine اور alpha-7.3 giardine میزبان ماؤس NLRP3 سوزش کو چالو کرتے ہیں، ماؤس کے جسمانی وزن میں اضافہ کرتے ہیں، آنتوں کے لیویج سیال میں ٹرافوزائیٹس کی تعداد کو کم کرتے ہیں، اور پیتھولوجیکل گرہنی کے گھاووں کو کم کرتے ہیں۔یہ نتائج بتاتے ہیں کہ G. duodenalis NLRP3 میزبان سوزش کو الفا-2 giardine اور alpha-7,3 giardine کے ذریعے فعال کر سکتا ہے، جس سے چوہوں میں G. duodenalis کی روگجنکیت کم ہوتی ہے۔
اجتماعی طور پر، ہمارے نتائج یہ ظاہر کرتے ہیں کہ الفا-2 اور الفا-7.3 جارڈائنز NLRP3 میزبان سوزش کو متحرک کرتے ہیں اور چوہوں میں G. duodenalis کی انفیکشن کو کم کرتے ہیں۔لہذا، یہ مالیکیول giardiasis کی روک تھام کے لیے امید افزا اہداف ہیں۔
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
لیانگ اے کے ایس، لیانگ اے اے ایم، ہوانگ اے ایچ سی، سرگی کے ایم، کام جے کے ایم۔Giardiasis: ایک جائزہ۔حال ہی میں یہ انکشاف ہوا تھا کہ پیٹ انفلام کو دوائیوں سے الرجی ہے۔2019؛ 13:134-43۔
Escobedo AA، Tsimerman S. Giardiasis: فارماکو تھراپی کا جائزہ۔ایک فارماسسٹ کی ماہرانہ رائے۔2007;8: 1885–902۔
تیان ہوافینگ، چن بن، وین جیان فینگ۔Giardiasis، منشیات کے خلاف مزاحمت اور نئے اہداف کی دریافت۔ڈس آرڈر منشیات کے اہداف کو متاثر کرتا ہے۔2010؛ 10:295–302۔
Wang Z، Zhang X، Xiao Yi، Zhang W، Wu X، Qin T، وغیرہ NLRP3 سوزش اور سوزش کی بیماریاں۔آکسائڈ میڈ سیل لانگیو۔2020؛ 2020:4063562۔
Chen GY، Núñez G. آنتوں کی سوزش اور کینسر میں سوزش کا کردار۔معدے.2011;141:1986-99۔
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical and atypical NLRP3 inflammasome ایکٹیویشن مدافعتی رواداری اور گٹ کی سوزش کے سنگم پر۔پری امیون.2017؛ 8:36۔
لی ایل، وانگ ایکس سی، گونگ پی ٹی، ژانگ این، ژانگ ایکس، لی ایس، وغیرہ۔ROS کی ثالثی NLRP3 سوزش ایکٹیویشن N. caninum انفیکشن کے جواب میں شامل ہے۔پرجیوی ویکٹر۔2020؛ 13:449۔